DESeq2文庫標(biāo)準(zhǔn)化
問題1：調(diào)整文庫大小的差異
樣本1的read是樣本2的一半,樣本2中每個(gè)基因的read是樣本1的兩倍。這種差異不是生物學(xué)造成的，而是測序深度造成的。RPKM，F(xiàn)PKM，TPM和CPM都處理這個(gè)問題。
問題2:調(diào)整文庫組成的差異：
RNA-seq(和其他高通量測序)經(jīng)常被用來比較一種組織類型和另一種組織類型。例如，肝臟vs脾臟。這可能是因?yàn)楦闻K中轉(zhuǎn)錄有很多肝臟特異性基因，而脾臟中卻沒有。這是一個(gè)不同的文庫組成(library composition)的例子,你也可以想象，如果你敲除一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，在同一種組織類型中，你會發(fā)現(xiàn)不同的文庫組成。
在這個(gè)例子中，兩個(gè)文庫有相同的大小(read)，現(xiàn)在，假設(shè)所有基因的表達(dá)都是一樣的，只有一個(gè)例外。假設(shè)只有樣本1轉(zhuǎn)錄A2M, 這意味著樣本1中A2M消耗掉的563個(gè)reads,這563reads將會分布到樣本2中的其他基因上。在樣本2中，除了A2M之外，所有的reads都非常高。然而，唯一的差異表達(dá)基因是A2M。
上傳失敗...(image-dfdecb-1610511799293)
編寫DESeq2(和edgeR)的人意識到他們的工具將用于各種類型的數(shù)據(jù)集，所以他們希望他們的標(biāo)準(zhǔn)化去處理:
問題1：調(diào)整文庫大小的差異
問題2:調(diào)整文庫組成的差異：
我們將從一個(gè)小數(shù)據(jù)集開始，說明DESeq2如何縮放(scale)不同的樣本。目標(biāo)是為每個(gè)樣本計(jì)算一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化因子(scaling factor)。標(biāo)準(zhǔn)化因子必須考慮到read depth和library composition。
第一步：對全部值取log
DESeq2使用了log(“以e為底的log”)
DESeq2可以使用log2或log10，但在R中l(wèi)oge默認(rèn)值。
注意log(0) =-∞，這是因?yàn)镽定義log(0)等于-∞。
第二步：每行取平均值
任何時(shí)候你把一個(gè)數(shù)字加到無窮(或-無窮)你會得到無窮(或-無窮)，這就是為什么這是負(fù)無窮。因?yàn)镚ene1是負(fù)無窮，所以平均值也是負(fù)無窮。
對數(shù)值的平均值有一件很酷的事情，那就是這個(gè)平均值不容易被異常值所影響。同理，我們可以看Gene3，存在異常值，取對數(shù)后，影響減小。
第三步：過濾掉值為負(fù)無窮的基因
一般來說，這一步在一個(gè)或多個(gè)樣本中過濾掉read為零的基因。
如果你在比較肝臟和脾臟，這將去除所有只在肝臟(或脾臟)轉(zhuǎn)錄的基因。
理論上，這有助于將標(biāo)準(zhǔn)化因子集中在管家基因上——無論組織類型如何，基因轉(zhuǎn)錄水平都是相似的。
第四步:從log(counts)中減去平均對數(shù)值
- 我們要檢查的是每個(gè)樣本讀取數(shù)與所有樣本均值的比。
第五步:計(jì)算每個(gè)樣本比的中位數(shù)(median)
注意:使用中位數(shù)是另一種避免極端基因在一個(gè)方向上過度影響的方法
表達(dá)差異較大的基因?qū)χ形粩?shù)的影響并不比表達(dá)差異較小的基因大，因?yàn)榫哂芯薮蟛町惖幕驑O有可能是罕見的，因此，這種效應(yīng)會給差異較小的和“管家”基因帶來更大的影響。
第六步:將中位數(shù)轉(zhuǎn)換為“正態(tài)數(shù)”，得到每個(gè)樣本的最終的標(biāo)準(zhǔn)化因子
這些是對數(shù)值，所以它們是指數(shù)(這里是e的指數(shù))
太棒了! !我們有三個(gè)樣本的標(biāo)準(zhǔn)化因子，現(xiàn)在我們要做的就是把原始的reads除以它們。
第七步：將原始reads除以標(biāo)準(zhǔn)化因子
