31、第三十一計(jì) 美人計(jì)
以美女誘人的計(jì)策。
此計(jì)是說利用敵人自身的嚴(yán)重缺點(diǎn)，己方順勢以對(duì)，使其自頹自損，己方一舉得之。
基礎(chǔ)不牢，地動(dòng)山搖，單細(xì)胞有時(shí)候也要計(jì)算這些值。
簡寫
RPKM: Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的reads)
FPKM: Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments)
RPM/CPM: Reads/Counts of exon model per Million mapped reads (每百萬映射讀取的reads)
TPM：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads (每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Transcripts)
RPKM,FPKM,TPM標(biāo)準(zhǔn)化方法出現(xiàn)的必然性
在RNA-Seq的分析中，為了獲得差異表達(dá)基因，只需要對(duì)不同基因的測序Read數(shù)進(jìn)行比較即可。然而比對(duì)到不同基因上的Read數(shù)目并不能直接用于比較這兩個(gè)基因的表達(dá)量差異，因?yàn)樵赗NA-seq中有一個(gè)很淺顯的道理，基因越長，比對(duì)到此基因上的Read就會(huì)越多；測序深度越大，那么本次RNA-seq的所有Read數(shù)都會(huì)增加。也就是說Read數(shù)除了和基因表達(dá)量相關(guān)外，也和 基因的長度、測序深度 有關(guān)，因此為了比較多個(gè)RNA-seq重復(fù)（測序深度有一定差異）的不同基因（基因長度有一定差異）之間的表達(dá)量差異，那么就不能使用Read數(shù)直接進(jìn)行比較，而是需要對(duì)Read數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
FPKM
計(jì)算公式
RPKM = total exon reads/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))
你可以用這個(gè)公式計(jì)算基因，外顯子，轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，這里以基因的表達(dá)為例進(jìn)行說明：
total exon reads：某個(gè)樣本mapping到 特定基因 的外顯子上的所有的reads；
mapped reads (Millions) :某個(gè)樣本的 所有 reads總和；
exon length(KB)：某個(gè)基因的長度（外顯子的長度的總和，以KB為單位）
分析
測序read數(shù)會(huì)受到基因長度和測序深度影響，解決方案如下
1、受到基因長度影響，那么將測序Read數(shù)除以基因長度就OK了；2、受到測序深度影響，那么再將Read數(shù)除以總Read數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化也就消除了測序深度的影響。
基因長度是用 kb表示的，所以RPKM中是K，Kilobase。而總Read數(shù)太大了，直接除以這個(gè)數(shù)字就會(huì)使得標(biāo)準(zhǔn)化出來的Read數(shù)出現(xiàn)太多的小數(shù)，所以為了美觀，一般都是除以以百萬為單位的總Read數(shù)，舉例來說，假定一次RNA-seq的總Read數(shù)為2*10^7，那么在進(jìn)行Read標(biāo)準(zhǔn)化的時(shí)候，并不是直接除以這個(gè)數(shù)值，而是除以20，因?yàn)?code>2*10^7 = 20*10^6 = 20M，所以RPKM中才是 M ，Million。
RPKM的計(jì)算方法
計(jì)算總Read數(shù)：計(jì)算每一個(gè)RNA-seq樣本的總Read數(shù)，然后將其換算為以百萬位單位（M）；
標(biāo)準(zhǔn)化基因的Read數(shù)（消除測序深度）：將所有基因的Read數(shù)除以總Read數(shù)；
標(biāo)準(zhǔn)化基因長度（消除基因長度）：再用標(biāo)準(zhǔn)化基因的Read數(shù)除以基因長度（基因長度單位為kb）；
例子
舉例來說，假定有以下RNA-seq數(shù)據(jù)，測定了A、B、C、D四個(gè)基因，長度分別是2、4、1、10kb，共測定了3個(gè)生物重復(fù)：Rep1、Rep2、Rep3。
第一步，計(jì)算總Read數(shù)
由于只有4個(gè)基因，所以總Read數(shù)并沒有太大，因此使用10模擬百萬進(jìn)行總read換算。
第二步：標(biāo)準(zhǔn)化總Read數(shù)
將Rep1、Rep2、Rep3除以各自換算后的總Read數(shù)（也就是3.5，4.5，10.6），得到RPM，見下圖：
第三步：標(biāo)準(zhǔn)化基因長度
再將基因A、B、C、D的RPM值除以各自的基因長度，得到RPKM，見下圖：
如此一個(gè)RPKM標(biāo)準(zhǔn)化就完成了。
FPKM
其實(shí)FPKM同RPKM是一樣的，只是RPKM用于單末端測序，而FPKM用于雙末端測序。
二代測序時(shí)，會(huì)將所有的DNA打成片段（fragment），然后再去測序。單末端測序時(shí)，一個(gè)片段對(duì)應(yīng)一個(gè)Read，但是雙末端測序時(shí)，一個(gè)片段會(huì)從兩端分別測定一次，因此這兩個(gè)配對(duì)Read對(duì)應(yīng)的是同一片段（偶爾也會(huì)有一個(gè)片段只對(duì)應(yīng)一個(gè)Read的情況，另一個(gè)Read因?yàn)槟承┰虮惶蕹騺G失了）。
區(qū)別也就在這里，對(duì)于FPKM來說，配對(duì)到同一片段上的兩個(gè)Read只會(huì)算作一個(gè)Read，也就是說FPKM是以Fragment為準(zhǔn)，不以Read數(shù)為準(zhǔn)，其他計(jì)算方式是完全一樣的。
補(bǔ)充：對(duì)于單末端測序, 雖然理論上FPKM等同于RPKM, 但是實(shí)際上即使是使用同一個(gè)mapping軟件得到的mapping結(jié)果, 然后再分別去計(jì)算同一個(gè)基因的RPKM (自己人工計(jì)算，或者用現(xiàn)成的一些軟件都能算) 和FPKM (用Cufflinks/Stringtie計(jì)算), 結(jié)果卻仍然是不同, 因?yàn)椴煌浖凶约旱哪Ｐ秃妥约旱囊恍﹥?nèi)在算法。)
TPM
分析
TPM的計(jì)算方法其實(shí)同RPKM很類似，同樣的對(duì)基因長度和測序深度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，只不過RPKM是先進(jìn)行測序深度標(biāo)準(zhǔn)化，后進(jìn)行基因長度標(biāo)準(zhǔn)化；而 TPM是先進(jìn)行基因長度標(biāo)準(zhǔn)化，后進(jìn)行測序深度標(biāo)準(zhǔn)化 。事實(shí)證明，TPM的標(biāo)準(zhǔn)化方法更有優(yōu)勢，為何會(huì)這樣，見后述。這里先看看TPM的計(jì)算。
例子
第一步：進(jìn)行基因長度標(biāo)準(zhǔn)化。先將基因A、B、C、D的Read數(shù)除以各自的基因長度（基因長度單位kb），得到RPK。
第二歩：計(jì)算總Read數(shù)（RPK）。計(jì)算總Read數(shù)，并將其進(jìn)行百萬轉(zhuǎn)換。由于基因數(shù)太少，這里是使用10模擬百萬轉(zhuǎn)換。
由于TPM先進(jìn)行基因長度標(biāo)準(zhǔn)化，所以這里的總Read數(shù)計(jì)算已經(jīng)變?yōu)榛蜷L度標(biāo)準(zhǔn)化后的Read數(shù)，也就是RPK數(shù)。
第三步：進(jìn)行總Read數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。將Rep1、Rep2、Rep3的RPK除以各自的轉(zhuǎn)換后的總Read數(shù)，得到TPM值。
TPM的計(jì)算方法
標(biāo)準(zhǔn)化基因長度：將所有基因的Read數(shù)除以基因長度（基因長度單位為kb）；
計(jì)算總Read數(shù)：計(jì)算每一個(gè)樣本的總Read數(shù)，然后將其換算為以百萬位單位（M）；
標(biāo)準(zhǔn)化總Read數(shù)：將所有基因的Read數(shù)除以總Read數(shù)；
TPM相比較RPKM,FPKM的優(yōu)勢
目前都已經(jīng)推薦進(jìn)行TPM標(biāo)準(zhǔn)化，不再使用了RPKM、FPKM了，為何會(huì)這樣？
先看看剛才的RPKM和TPM數(shù)據(jù)：
將每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的相應(yīng)RPKM和TPM值進(jìn)行加總后，可以發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)錄本的總RPKM并不相同，而進(jìn)行TPM變換后的加總TPM值是相同的。事實(shí)上所有進(jìn)行TPM變換后的轉(zhuǎn)錄本的加總TPM值都是相同的（正常情況下，是百萬）。
這個(gè)差異會(huì)造成什么樣的影響呢？
由于RNA-seq就是為了通過比較不同樣本間的標(biāo)準(zhǔn)化后的Read數(shù)差異來得出基因表達(dá)量差異的結(jié)果的，那么不同樣本的加總RPKM不同，就會(huì)導(dǎo)致無法通過直接比較RPKM值確定兩者的差異。
舉例來說，在不考慮統(tǒng)計(jì)差異的情況下，以基因A為例，Rep1的RPKM值為1.43，Rep3的RPKM值是1.42，那么能說基因A在Rep1中的表達(dá)量大于Rep3中的表達(dá)量嗎？
答案是不能，因?yàn)镽ep1的總RPKM值是4.29，而Rep3的總RPKM值是4.25，雖然Rep1中基因A的RPKM大，但是Rep1的總RPKM值也是較大的（說白了，RPKM的測序深度標(biāo)準(zhǔn)化并不完善）。
而對(duì)于TPM數(shù)據(jù)就不同了，由于總TPM都是相同的，Rep1中基因A的TPM值3.33大于Rep3中基因A的TPM值3.326，所以在不考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的情況下，可以直接得出Rep1中基因A的表達(dá)量是要大于Rep3的。
參考：http://www.360doc.com/content/18/0508/22/19913717_752279133.shtml
作者：NoviceWitch
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來源：簡書
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