Cell | 人類實體瘤臨床細胞狀態(tài)和生態(tài)系統(tǒng)圖譜

原創(chuàng)?huacishu?圖靈基因?今天

收錄于話題#前沿生物大數(shù)據(jù)分析

撰文：huacishu

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1、在這項研究中，作者描述了EcoTyper，一個從基因表達數(shù)據(jù)解碼細胞狀態(tài)和多細胞群落的集成系統(tǒng)。它可以通過直接從完整組織活檢的RNA圖譜輸入細胞異質(zhì)性，避免了物理細胞分離引起的畸變；不需要抗體或表型標記的預選，適用于新鮮、冷凍和固定標本；EcoTyper還可以準確解析多種細胞類型的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，將它們組裝成多細胞群落，量化它們的相對組成；

2、盡管在這項研究中EcoTyper被應用于16種癌，但它可以推廣到任何組織類型和疾病狀態(tài)，并且可以獲得合適的表達數(shù)據(jù)。

近日斯坦福大學Aaron Newman教授團隊在國際知名期刊Cell在線發(fā)表題為“Atlas of clinically distinct cell states and ecosystems across human solid tumors”的研究論文。確定細胞如何隨著其局部信號環(huán)境而變化并形成不同的細胞群落對于理解發(fā)育、衰老和癌癥等多種過程至關(guān)重要。本研究作者介紹了EcoTyper，這是一個機器學習框架，用于從大量單細胞和空間解析的基因表達數(shù)據(jù)中識別和驗證細胞狀態(tài)和多細胞群落。當應用于16種人類癌癥的12個主要細胞譜系時，EcoTyper鑒定出69種被轉(zhuǎn)錄定義的細胞狀態(tài)。大多數(shù)狀態(tài)是腫瘤組織特有的，普遍存在于各種腫瘤類型中。這項研究闡明了人類癌細胞組織的基本單位，并為大規(guī)模分析組織中的細胞生態(tài)系統(tǒng)提供了框架。

研究設(shè)計了EcoTyper作為一個廣泛適用的框架，用于從原始組織標本高通量鑒定細胞狀態(tài)和多細胞群落。它包括三個關(guān)鍵步驟：從大量組織轉(zhuǎn)錄組中獲得細胞類型特異性基因表達譜，識別和定量轉(zhuǎn)錄定義的細胞狀態(tài)，以及將細胞狀態(tài)分配到多細胞群落（圖1）。接下來設(shè)計了一個隊列，由16種人類癌癥組成，包括5946個腫瘤和529個相鄰的正常轉(zhuǎn)錄組，由癌癥基因組圖譜（TCGA）分析（圖1）。選擇這些數(shù)據(jù)集是為了最大限度地提高標本處理的一致性以及每個生物樣本的基因組數(shù)據(jù)和臨床隨訪的可用性。對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)一處理和標準化后，EcoTyper生成了一個包含77700個數(shù)字表達譜的矩陣，每個被評估的細胞類型和患者樣本各一個。

在初始質(zhì)量控制過濾（STAR方法）之后，EcoTyper產(chǎn)生了71種離散的細胞狀態(tài)，每個細胞類型的狀態(tài)從3到9個不等（圖2A、2B）。大多數(shù)狀態(tài)在癌癥中普遍存在，并在惡性組織中顯著富集。為了評估EcoTyper定義的71種細胞狀態(tài)的保真度，作者詢問了約200000個單細胞轉(zhuǎn)錄組中每種狀態(tài)的存在情況，這些轉(zhuǎn)錄組涵蓋四種人類癌癥：乳腺癌（BRCA）、結(jié)直腸癌（CRC）、頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）和非小細胞肺癌?？傊?，使用參考指導注釋結(jié)合排列測試，94%的細胞狀態(tài)（71個中的67個）在scRNA序列數(shù)據(jù)中可以顯著恢復。無論平臺、單元類型或數(shù)據(jù)集如何，恢復率都很高，這突出了結(jié)果的穩(wěn)定性。此外，在所有七個scRNA-seq腫瘤圖譜中觀察到顯著可重復的標記基因表達（圖2C）。作者還測試了特定生物組（如正常組織）中富集的狀態(tài)是否在單細胞水平上重現(xiàn)。事實上，在將單細胞轉(zhuǎn)錄組映射到EcoTyper狀態(tài)后，觀察到鄰近正常組織、腺癌或鱗狀細胞癌中富集狀態(tài)的顯著一致性（圖2D）。此外，與其他用于監(jiān)督scRNA序列分類的參考引導注釋工具相比，EcoTyper表現(xiàn)出了優(yōu)越的性能。重要的是，近三分之一的生態(tài)型狀態(tài)似乎是新的，或者之前未通過人類癌的scRNA-seq調(diào)查確定。例如，在M2樣巨噬細胞中，作者確定了一個AEBP1+群體（狀態(tài)6），該群體與泡沫狀巨噬細胞具有顯著的相似性，泡沫狀巨噬細胞是一種富含脂質(zhì)的表型，通常與動脈粥樣硬化斑塊相關(guān)，但其在癌癥中的相關(guān)性尚不清楚。為了證實這種狀態(tài)，根據(jù)從人結(jié)直腸癌腫瘤活組織切片中分離的基質(zhì)細胞進行了大量RNA-seq檢測，在EcoTyper鑒定的九種單核細胞/巨噬細胞狀態(tài)中，狀態(tài)6在富含泡沫巨噬細胞的基質(zhì)中富集，這也支持了研究的結(jié)果（圖2E）。

在隊列調(diào)查的16種上皮癌類型中，大多數(shù)細胞狀態(tài)（69種中的39種）與總生存率顯著相關(guān)（圖3A），49%（n=34）在結(jié)合分期、年齡和性別的多變量分析中顯著相關(guān)。將幾乎所有評估的細胞類型分為有利和不利狀態(tài)，突出了它們的生物學和臨床異質(zhì)性（圖3A）。例如，在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，注釋為M1（狀態(tài)3）和M2（狀態(tài)4-7）的巨噬細胞亞群分別與更長和更短的生存時間相關(guān)（圖3A）。令人驚訝的是，在M2樣狀態(tài)中，AEBP1+泡沫巨噬細胞是不良生存的前五個決定因素之一，這表明泡沫細胞作為癌癥的免疫治療靶點具有廣泛的相關(guān)性（圖3A）。值得注意的是，TCGA和PRECG之間的生存關(guān)聯(lián)高度一致（圖3B），證實了作者的發(fā)現(xiàn)，并強調(diào)了EcoTyper對新數(shù)據(jù)集的可擴展性。作者還觀察到個別腫瘤類型的高度一致性，如結(jié)腸癌、卵巢癌和胃癌，其中M1和M2泡沫樣巨噬細胞分別預測更長和更短的生存時間（圖3C）。

腫瘤是由空間和時間連接的細胞狀態(tài)組成的復雜生態(tài)系統(tǒng)。為了確定EcoTyper是否能夠重建多細胞生態(tài)系統(tǒng)，作者設(shè)計了一種基于共生和相互回避模式的數(shù)據(jù)驅(qū)動的細胞狀態(tài)聚類方法（STAR方法）。通過將該方法應用于發(fā)現(xiàn)隊列中的腫瘤樣本，研究確定了十個顯著緊密結(jié)合的細胞群落，稱之為“癌癥生態(tài)型”（CEs）（圖4A、4B）。CEs的范圍為每個群體3到9個不同的細胞狀態(tài)（圖4A和4B），獨立于聚類方法得到了穩(wěn)健的恢復，在人類癌癥中普遍存在（圖4A），并且與最近描述的TCGA免疫亞型高度不同。雖然幾乎每個腫瘤樣本都有一個顯性CE（圖4A），但大多數(shù)腫瘤由多個CE組成，突出了腫瘤組織成分的模塊化。鑒于這些結(jié)果，接下來詢問在單細胞數(shù)據(jù)中是否可以檢測到這十種CEs。使用上述scRNA-seq，其中包括約200000個單細胞轉(zhuǎn)錄組，包括76個腫瘤和21個來自四種癌癥的正常標本，將單個細胞分配到生態(tài)型狀態(tài)（圖4C）。然后，確定每個腫瘤/正常樣本中每個狀態(tài)的豐度分數(shù)，并隨后將細胞狀態(tài)分組到EcoTyper定義的相同CE類別中（圖4C-4E）?？偟膩碚f，80%的CEs在scRNA-seq數(shù)據(jù)中顯著可檢測到（p<0.05）。此外，90%在p<0.06時可檢測到（圖4D）。

在確定了癌癥中十種主要的多細胞生態(tài)系統(tǒng)之后，接下來探討了它們的細胞、基因組和臨床特征（圖5A）。在發(fā)現(xiàn)隊列中，8個CE在單變量模型中具有顯著的預后，5個CE在對分期、年齡和性別進行多變量調(diào)整后仍然具有顯著性（圖5A）。值得注意的是，兩種CEs在腫瘤和鄰近正常組織中出現(xiàn)的頻率相似，但在健康組織中消失（CE4、CE10），這反映了潛在的場效應。除CE6外，其他主要針對腫瘤組織（圖5B）。為此，收集了571例晚期轉(zhuǎn)移性疾病患者在接受抗PDL1（尿路上皮癌）、抗PD1（黑色素瘤）或抗CTLA4（黑色素瘤）單藥治療前的腫瘤表達數(shù)據(jù)。為了量化療效，評估了與總生存率的持續(xù)相關(guān)性和與免疫治療反應的二元相關(guān)性。以IFN-g信號為特征的CE9在預測不同治療類型和結(jié)果指標的優(yōu)越結(jié)果方面優(yōu)于其他CE（圖5C）。還將CE譜分析與112個候選生物標記物進行了比較，其中包括69個由EcoTyper定量的細胞狀態(tài)、25個由CIBERSORTx計數(shù)的群體、腫瘤突變負荷（TMB）和2個已發(fā)表的ICI反應。令人驚訝的是，CE9豐度超過了所有其他指標，包括那些經(jīng)過培訓預測ICI反應的指標（圖5C）。這些數(shù)據(jù)表明，即使在沒有優(yōu)化的情況下，多細胞群落也可以捕獲具有較高預測價值的生物信號。

接下來，作者試圖確定癌生態(tài)型是否顯示出不同的空間組織模式。為此，作者主要關(guān)注CE9和CE10，這兩個促炎細胞群落具有典型的T細胞狀態(tài)和良好的總體存活率，但在其他方面基因組和細胞特征不同（圖5）。CE9-T細胞狀態(tài)表達免疫調(diào)節(jié)基因，包括衰竭標記物，與CE9與ICI反應的相關(guān)性一致。相反，CE10-T細胞表達中樞記憶細胞的標記物（圖6A）。通過EcoTyper，做作者發(fā)現(xiàn)CE9-T細胞與六種細胞狀態(tài)強烈共存，包括類似M1巨噬細胞、成熟免疫原性樹突狀細胞和活化的B細胞。相反，CE10-T細胞與五種細胞狀態(tài)同時出現(xiàn)，包括與促炎癥單核細胞、cDC1樹突狀細胞和原始/靜息B細胞一致的細胞狀態(tài)（圖4B和6A）。為了檢查CE特異性表型是否在空間上不同，首先對GZMB和GZMK進行免疫熒光（IF）染色（圖6B），這兩種細胞分別標記CE9和CE10-T細胞（圖6A）。在癌癥中，已經(jīng)觀察到GZMB和GZMK分別區(qū)分激活效應器記憶T細胞和過渡效應器記憶T細胞。將EcoTyper應用于非小細胞肺癌患者的23個腫瘤轉(zhuǎn)錄組，并選擇了四個具有不同CE9和CE10組成的標本。這些標本的染色證實了EcoTyper的預測。此外，雖然GZMB+T細胞定位于腫瘤核心，與慢性抗原刺激和T細胞耗竭之間的聯(lián)系相一致，但GZMK+T細胞基本上被排除在外，而不是定位于外周（圖6B）。為了將分析擴展到T細胞之外，進一步將熒光成像應用于載脂蛋白E+/CD68+和CCR2+/CD68+細胞，它們分別標記巨噬細胞/單核細胞系中的CE9-和CE10富集狀態(tài)（圖6A）。利用上述分析中的腫瘤標本，證實了免疫熒光測定的相對細胞狀態(tài)豐度與EcoTyper測定的相對細胞狀態(tài)豐度一致。如對T細胞所觀察到的，APOE+/CD68+細胞定位于腫瘤核心，而CCR2+/CD68+細胞定位于腫瘤外周（圖6B）。此外，生態(tài)型與腫瘤細胞之間的距離存在高度顯著的空間差異（圖6C），這一發(fā)現(xiàn)可擴展到黑色素瘤標本（圖6C）。為了確定其他細胞類型和癌癥是否顯示CE特異性共定位模式，接下來探索了通過空間轉(zhuǎn)錄組學分析的乳腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌和黑色素瘤樣本中的細胞狀態(tài)相關(guān)性（圖6D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論發(fā)育譜系或癌癥類型如何，細胞狀態(tài)通常以CE特異性方式共定位（圖6E）。此外，在從33名結(jié)果已知的受試者收集的肺鱗狀細胞癌癌前病變中，較高的CE10相對水平與自發(fā)消退顯著相關(guān)，而較高的CE9相對水平則預測進展為浸潤性癌（圖6F）。這些數(shù)據(jù)進一步驗證了作者的方法，將CE動力學與早期肺癌發(fā)展聯(lián)系起來，并提供了一個平臺來系統(tǒng)地研究腫瘤細胞生態(tài)系統(tǒng)的診斷和治療潛力。

總之，該研究展示了如何從大量組織轉(zhuǎn)錄組中分析細胞狀態(tài)和多細胞群落，在獨立于平臺的表達數(shù)據(jù)集中恢復，與免疫治療反應相關(guān)，并跨空間和發(fā)育時間進行追蹤。該方法是準確的，是對現(xiàn)有單細胞分析的補充，并且在產(chǎn)生可實驗驗證的假設(shè)方面具有重大潛力。鑒于EcoTyper的獨特功能，作者預計EcoTyper將在健康和疾病的預防和治療中發(fā)揮重要的作用。

教授介紹

Aaron Newman教授的團隊結(jié)合計算和實驗技術(shù)來研究細胞組織，重點是確定腫瘤細胞亞群的表型多樣性和臨床意義。其中特別感興趣的是開發(fā)創(chuàng)新的數(shù)據(jù)科學工具，以闡明腫瘤發(fā)生、進展和治療反應的細胞層次結(jié)構(gòu)和基質(zhì)成分。并且開發(fā)了新的算法，從臨床生物樣本的基因組圖譜中解析細胞狀態(tài)和多細胞群落、腫瘤發(fā)育層次和單細胞空間關(guān)系。并且Aaron Newman教授以通訊作者在國際權(quán)威期刊Cell、Science、Nature biotechnology等雜志上發(fā)表論文多篇。

參考文獻

Luca BA, Steen CB, Matusiak M, et al. Atlas of clinically distinct cellstates and ecosystems across human solid tumors. Cell.2021;S0092-8674(21)01061-8. doi:10.1016/j.cell.2021.09.014