搜庫前準(zhǔn)備
搜庫前應(yīng)重裝系統(tǒng)，清空不必要的東西，可在服務(wù)器A4, A5重裝win7 PE版本（自帶U深度PE裝機(jī)工具）;安裝完后需要激活一下win7
安裝，均在A4服務(wù)器的C盤
apache(一個網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器)安裝:D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
點擊exe安裝, 填寫郵箱名可以是假的，但必須跟后面保持一致（如66@.com）；登錄localhost時（http://127.0.0.1/）出現(xiàn) it works！為安裝成功Perl x64 語言安裝 （Mascot是基于Perl語言編寫的）
D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
3.Mascot x64 安裝:D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
安裝時，要找到安裝包內(nèi)的mascot.licence 的具體路徑，將其粘到指定的licence 框內(nèi)
mascot.licence 的具體路徑: D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
為了讓apache讀懂Mascot，需要將/MASCOT/ 文件夾內(nèi)的httpd.config文件中的全部內(nèi)容，黏貼到/apache/文件夾內(nèi)的httpd.config文件尾部，保存后重新打開apache，restart一下apache，再刷新Mascot網(wǎng)頁。成功則可看見Mascot 網(wǎng)頁的相關(guān)搜庫內(nèi)容。
PS: 若刷新網(wǎng)頁失敗，多半是因為apache沒有被打開，或重啟成功，多重啟嘗試則可！
4.Netframework 安裝
為了可對搜庫進(jìn)行批量操作，需要使用Daemon，但Daemon安裝前，需要安裝Netframework 4.5版本，Netframework在此類似JAVA，用于解釋.exe軟件
存放路徑：D:\Software\Drivers\Package\NetFramework
PS: 1. Netframework 4.5用于win 7電腦；若在win10 上安裝Daemon，則不需要安裝Netframework
Daemon 安裝（也稱Mascot Daemon）D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3
Daemon可對搜庫進(jìn)行批量操作。Scaffold安裝 D:\Program\Proteome\Q+S
1）重裝服務(wù)器后，本機(jī)的時間需要該licence的時間，安裝時將licence 粘進(jìn)對應(yīng)的框（sn.txt文件為licence）
2）在【控制面板】，進(jìn)入【防火墻】，高級設(shè)置，選【出站規(guī)則】，【新建規(guī)則】，選【程序】，將Scaffold文件夾下的 jre/bin/javaw.exe block掉， 選【阻止連接】，再隨便重命名一下
c:/program file/scaffold 4
MASCOT搜庫
- peptide Mass Fingerprint 是按蛋白的KD數(shù)進(jìn)行搜庫；
- 單個Raw文件可在Ions Search進(jìn)行搜庫，但前提需要將raw文件的.wiz格式轉(zhuǎn)為mgf格式
3.搜庫前建庫：
1）可在uniprot上下載所需的物種參考氨基酸序列：
在Taxonmy下，選view protein，選擇Swiss prot(這個參考序列屬于一個基因?qū)?yīng)一個全長protein)，
選擇.fasta格式進(jìn)行下載 （有時候注釋時也需要將其.txt格式的文件一起下載）
2）進(jìn)入MASCOT網(wǎng)頁，導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫http://a4/mascot
在 Configuration editor進(jìn)入，選database maintence, 進(jìn)入建庫操作面板，修改：
（1）選上Active, AA(氨基酸)，mem lock(把數(shù)據(jù)放入內(nèi)存進(jìn)行搜庫)；
（2）將路徑C:/MASCOT/sequence/Mouse/GRCm38.fa輸入指定框，并修改為：C:/MASCOT/sequence/Mouse/GRCm38*.fa
（3）只保留parse accession 和 parse description 這兩項，并且parse accession選4th項，parse description 選5th項，后面的空格全清空，再點擊test definition 看格式是否喜歡，最后確定正確不報錯時點擊Apply 使用。
（4）然后在MASCOT網(wǎng)頁database status（http:/a4/mascot/x-cgi/ms-status.exe）上瘋狂F5刷新，觀察status達(dá)到 In use(在刷新時，索引fasta文件會慢慢進(jìn)入MASCOT，需要稍等)
Daemon的搜庫前工作
1.先導(dǎo)入/IBS/文件夾已有的參數(shù)設(shè)置：D:\Program\Proteome\MASCOT_v2.3\IBS ,再保存為tmp.par，再在Task Editor導(dǎo)入，保存在/IBS/parameter/。
2.導(dǎo)入餾分，理論上每個餾分都單獨(dú)進(jìn)行搜庫；
PS: 餾分輸入下面有一個選項，[Merge MS/MS]，這一項適用于多個餾分對應(yīng)一個樣本的情況，才可以merge
- 在MASCOT建庫成功后，重啟Daemon 可見新庫已建入，run即可；
- 搜庫完成后，結(jié)果放在：MASCOT/data/.dat，均可用Scaffold進(jìn)一步整合分析，也可用高級版的MASCOT查看其他相關(guān)信息；
PS: 1. 理論上1個mgf文件對應(yīng)1個dat文件，均可在Daemon的進(jìn)程列表上查詢；
2.基本上按照輸入順序搜庫，序號為輸出的終止時間。
Scaffold整合文件及分析
官網(wǎng)下載Install_Scaffold_Q+S_5.2.0_Windows_x64或4.0版本，安裝后導(dǎo)數(shù)據(jù)。
- 將MASCOT/data/.dat的搜庫結(jié)果，先按組別名字劃分好文件夾，按組順序分別導(dǎo)入，如三次重復(fù)組：A,B,C仨組（x 21個餾分）分別進(jìn)入；
- 導(dǎo)入時若報錯memory不足，可在【Edit】中的【Preference】中，設(shè)置【Memory】為16G（16000MB）；
- 統(tǒng)計分析：進(jìn)入【Quant】中【Update Experimental Design】，設(shè)置：
- 設(shè)【Analysis Type】為Ratio-based;
- 設(shè)【Experiment Type】為Between-subjects(Independent Groups);
- 設(shè)【Edit Sample Names and Categories】設(shè)置組數(shù)以及對應(yīng)的組別顏色；
-
設(shè)【Organize Quant Samples】中，將每組對應(yīng)的餾分拖進(jìn)改組，設(shè)置【Reference】為control 組的餾分，F(xiàn)inish 后 Update Samples；
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- 保存為.sf3文件，方便后續(xù)導(dǎo)入；
- 導(dǎo)出數(shù)據(jù)前，可設(shè)置:
1)【hide decoys】去掉decoys;
- Min peptides=2 或FDR threshold=1%;
- Protein Threshold=99% , Peptides Threshold=95%(若蛋白過少，可放松倆閾值到90%);
4)選擇【Quant】中【Launch Q+ Quantitation Module】模塊，進(jìn)行需要一段時間，選擇【Display Options】為Fold Change Ratio，然后右鍵選擇【Copy All Data】，黏貼到新的Excel表格去。
