說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學網(wǎng)絡大課堂整理而成，侵刪。該課程由中國農(nóng)業(yè)大學生物學院的李溱老師所授。
主要知識點：
--液相色譜儀及組成
--液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)
液相色譜儀
1906年，一位叫Tsweet的俄國科學家，發(fā)現(xiàn)了這么一個現(xiàn)象：在一個玻璃管里放了一些碳酸鈣的粉末，也就是石灰粉，然后把胡蘿卜搗碎后的石油醚提取液加到柱子里，隨著石油醚的流動，他發(fā)現(xiàn)在柱子上形成不同的色帶，其實就是胡蘿卜里包含的各種色素在碳酸鈣柱子里被分離開了。由于觀察到不同的色帶，所以他管這種現(xiàn)象叫色譜。
我們通過下面的示意圖來理解一下這個現(xiàn)象的原理。胡蘿卜提取液中含有不同的色素，柱子上的碳酸鈣會對這些色素產(chǎn)生形成吸附作用，而不同的色素，因為理化性質(zhì)不同，則與碳酸鈣固定相的吸附作用力也不同。吸附力強的色素，在里面停留的時間就會長一些，比如說圖中的黃色物質(zhì)，它是最后被洗下來的，而吸附力弱的色素，比如綠色的物質(zhì)，就很容易被石油醚沖下來，所以它第一個被洗脫。
所以色譜分離的原理就是利用待分離物質(zhì)與固定相（比如上例中的碳酸鈣柱子）和流動相（比如用來沖洗色素的石油醚）之間相互作用的差異來實現(xiàn)分離。
根據(jù)相互作用類型的不同，色譜法又可以分為：
吸附色譜法：物理吸附法
分配色譜法：根據(jù)溶解度的不同，卻多肽疏水性的差異
離子交換色譜法：根據(jù)多肽等電點的差異，依靠陰陽離子相互作用
尺寸排阻色譜法：根據(jù)分子尺寸和分子量的不同
親和色譜法：利用抗原抗體和其它特異性作用
目前，在蛋白質(zhì)組學研究中，用得最多的就是分配色譜法，就是根據(jù)樣品在固定相與流動相之間溶解度的差異來實現(xiàn)多肽或蛋白的分離。實際上是利用了多肽或蛋白疏水性上的差異。
說到這里，問題就來了：在上一個例子中，固定相是碳酸鈣粉末，是固體，那么蛋白或者多肽怎么可能會溶解到固體中去呢？
這里我們需要解釋一下液相色譜的固定相。我們用的反相液相色譜的固定相叫做鍵合多孔硅膠。如果在電鏡下將這種材料顆粒放大，就能看到它的表面是一種多孔的結(jié)構(gòu)，長得有點像核桃的表面。
它的表面并不是純粹的二氧化硅，而是通過化學修飾的方法，鍵合上去一些C18（十八烷基硅烷）。比如下面這個反應的示意圖：
硅膠的表面是二氧化硅，水化之后形成硅羥基，然后通過化學反應，把圖中含有Si, Cl, C的化合物結(jié)合到二氧化硅上去，形成長鏈烷烴的結(jié)構(gòu)。長鏈烷烴其實就是一種油，通過這種化學反應，相當于在二氧化硅的表面涂上了一層油膜，只不過這不是簡單的涂抹，是“化學涂抹”，連接上去的油層是很穩(wěn)定牢靠的。于是，多肽就可以溶解在這層穩(wěn)定的油膜里。所以，對于疏水性更強的多肽，更容易溶解在油膜里，親水性強的多肽，則不容易溶解在油膜里，于是就實現(xiàn)了不同極性多肽的分離。
這種顆粒有多大呢？我們常用的液相色譜填料的顆粒直徑是在1.7μm - 5μm之間，是非常小的，與之前Tsweet例子里用的碳酸鈣粉末完全不在一個數(shù)量級上，碳酸鈣粉末顆粒的直徑是在100μm-200μm之間。
明白了液相色譜的原理以后，我們來學習一下它的構(gòu)成，主要有四個部分：
色譜儀組成
1、 色譜柱：玻璃柱+固定相
2、 流動相輸送系統(tǒng)：對于Tsweet那個實驗，沒有專門的輸送系統(tǒng)，是靠重力使得樣品流過固定相。對于現(xiàn)在的實驗來講，我們用的色譜柱填料是非常細的，只有一點幾微米到幾微米，這時候靠重力是很難讓流動相流下來的，而是需要用一個泵來把流動相擠壓下去。所以液相色譜要配一個泵系統(tǒng)，來輸送流動相。
3、 進樣系統(tǒng)：對于Tsweet實驗，只需要用手把樣品倒進柱子里，就算進樣了。而現(xiàn)在我們都是用密封的系統(tǒng)，需要一個自動進樣器來完成。
4、 檢測系統(tǒng)：現(xiàn)在常用的有紫外或熒光，最簡單的就是用肉眼來觀察是否有樣品流出。
一個液相色譜儀，通常就是由這四個模塊組成。我們來看下面兩個實物圖。左邊是戴安的液相色譜儀，從上往下依次是泵系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、柱系統(tǒng)和檢測系統(tǒng)，右邊是Waters的液相色譜儀，也是類似的結(jié)構(gòu)。
對于我們蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域，常用的液相色譜儀是納升液相色譜。它與普通的液相色譜最大的區(qū)別就在管子的粗細和流速上。下圖是納升液相色譜的管路和接頭與常規(guī)液相色譜的比較。
首先，從外觀上我們也能看出很大的不同。常規(guī)液相色譜的柱子內(nèi)徑是在1-5mm，而納升液相色譜柱子就細了很多，與連接的管路粗細幾乎是一樣的，看上去就像一根線。加上外面的保護皮，這根線的外徑也只有360μm，如果把保護皮扒掉，外徑大概只有110μm-120μm，內(nèi)徑只有50μm。與常規(guī)的液相色譜柱相比，相當于把柱子的直徑縮小了20-100倍。
當我們把柱子的內(nèi)徑縮小了20-100倍以后，流動相的流速也相應地變緩了很多。常規(guī)液相色譜的流動相流速通常是在0.2-1ml/min，而納升液相色譜卻只有50-300nL/min，這與常規(guī)液相色譜的流速比，下降了1000倍。
那么，為什么我們需要將流速下降1000倍呢？要回答這個問題，我們先來看看下面這張納升色譜與常規(guī)色譜靈敏度的對比圖。
我們分析2 pmol的肌紅蛋白酶解產(chǎn)物，在不同直徑的柱子中的靈敏度。比如，在4.6mm的柱子里，流速為1ml/min，我們幾乎是看到紫外信號的；當我們把色譜柱逐漸縮細到1mm、300μm，直到180μm的時候，我們就可以看到非常清晰的紫外吸收峰，也就是酶解產(chǎn)物的譜圖。
為什么會出現(xiàn)這種現(xiàn)象呢？
我們來回顧一下，當常規(guī)液相色譜的流速是1ml/min時，也就是說，我的樣品會被1mL/min的液相所稀釋，而當我們用納升液相色譜時，我們會把流速降到300nL/min，相比于1mL/min，流速下降了3000倍，也就是說，樣品被變相地濃縮了3000倍。由于樣品的濃度被變相提高了很多，所以檢測的靈敏度也就相應提高了。
這就是為什么我們要使用納升液相色譜，就是為了減少樣品被流動相稀釋的倍數(shù)，從而提高檢測的靈敏度。
那么，納升液相色譜儀從外部看，有什么特點呢？其實它與常規(guī)液相色譜儀使用的泵都是一樣的，但是管路這部分是不同的。下面是一個實物圖，右側(cè)的局部圖展示的是流量控制器，進樣的管路還是跟常規(guī)管路一樣，是100mm的內(nèi)徑，而流出的管路外徑就變成了180μm，內(nèi)徑只有50μm，用了非常細的色譜柱，可以縮減流動過程中體積的延遲，或者梯度的延遲。
Tips:
梯度延遲是指梯度洗脫時色譜泵改變梯度后，色譜柱感受到這個變化所需要的延遲時間。常規(guī)液相色譜的梯度延遲約100-400微升，0.2-0.5 min，納升液相色譜約1-5微升，5-15分鐘。
介紹完液相色譜儀，我們再進一步說說，它是怎么與質(zhì)譜儀聯(lián)用的。
液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)
實際上，對于蛋白質(zhì)組學研究來說，液相色譜和質(zhì)譜是不能單獨工作的，它們必須聯(lián)機工作，才能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的檢測。那它們是怎么實現(xiàn)聯(lián)機的呢？可能你會說，弄個接口連起來唄！小編也覺得這是最直接的解決方案，但問題是，需要什么樣的接口？
要回答這個問題，我們先來看看將液相色譜和質(zhì)譜連接起來，需要面對哪些挑戰(zhàn)？液相色譜儀是在常溫常壓下工作的，柱子是放在空氣中運行的，而且樣品是溶解在流動相（水或有機溶劑）當中的。而質(zhì)譜儀需要在真空環(huán)境下工作，樣品需要從溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，而且需要被電離。所以總的來說，我們需要一個電離源，能把樣品從常溫常壓的液相狀態(tài)直接變成真空中的氣態(tài)離子狀態(tài)。
我們再來梳理一下這個電離源需要具備的功能：
電離源功能
功能一：去溶劑和氣化，把樣品中的溶劑去掉，將待檢測的多肽分子變成多肽的氣態(tài)分子；
功能二：將多肽的氣態(tài)分子離子化，讓它們帶上電荷；
功能三：把多肽的氣態(tài)離子送到真空當中。
僅用一個電離源，就能同時實現(xiàn)這么多的功能？聽上去貌似是件很難完成的任務！然后，就有這樣一種技術(shù)被機智的人類發(fā)現(xiàn)了出來，很好地實現(xiàn)了上述功能，它就是ESI，即電噴霧電離！順便說一句，這個技術(shù)的發(fā)明者，John Fenn，在2003年獲得了諾貝爾化學獎。
ESI的主要原理是這樣的：樣品首先通過一個毛細管噴針，被噴出來，進入質(zhì)譜儀。而在噴針的外面，會用一個鞘氣（sheath gas）來輔助樣品的霧化。這其實跟我們用的噴霧器或者噴壺是非常相似的道理。如果壓噴壺，噴壺里的氣或者水就會噴出來。
但是噴出來這一步，只能解決樣品的霧化問題，樣品實際上還是溶解在流動相中的。所以我們會對鞘氣進行加熱，當加熱的鞘氣吹到樣品中或者溶液中時，溶液中的流動相或者溶劑就會揮發(fā)，就會剩下氣態(tài)的離子。
同時，在毛細管噴針尖端與質(zhì)譜儀的入口之間，還會加一個電壓，叫High voltage，對這些待電離的分子，首先溶劑揮發(fā)掉，然后分子被氣化，最后在電場的作用下，分子就會變成離子，實現(xiàn)電離的過程。然后，這些離子會被質(zhì)譜儀入口處的真空抽到質(zhì)譜儀里，同時被電場驅(qū)動進入質(zhì)譜儀。于是，就實現(xiàn)了氣化、電離以及真空過渡三重需求。這就是液相色譜與質(zhì)譜的接口，即ESI電噴霧電離。示意圖如下：
對于蛋白質(zhì)組學研究來說，由于我們前面分離樣品的時候使用的是納升液相色譜，所以ESI電離源也需要做適當?shù)母倪M，來適應納升液相的特點，這種ESI我們叫做nanoESI，即納升電離源。
對于普通的電離源，當使用鞘氣的時候，電離源可以承受的流速通常是在0.1mL/min – 1mL/min，而納升電離源的流速只有100-500nL/min，這種超低流速下我們已經(jīng)不需要用鞘氣來輔助噴霧，只需要依靠樣品自身的揮發(fā)，以及樣品的噴針針尖與質(zhì)譜儀入口的電壓差，就可以實現(xiàn)穩(wěn)定的噴霧。也就是說，在這種情況下，我們只需要把噴針針尖的開口做得非常細（通常開口內(nèi)徑是在3-10μm），并且只需要1.5 -2.5kV的電壓，就可以實現(xiàn)連續(xù)穩(wěn)定的噴霧。
樣品通過這個噴針出來以后，就會發(fā)生霧化氣化，溶劑蒸發(fā)掉，然后樣品發(fā)生電離，進入質(zhì)譜。下面就是nanoESI的實物細節(jié)圖，右下角就是噴針的特寫照。
以上介紹的是液相色譜的原理，以及與質(zhì)譜的聯(lián)用方式，下一篇我們會聊到質(zhì)譜儀和納升液相色譜的使用與維護
