單細胞組學揭示COVID-19患者恢復期的免疫細胞圖譜

題目：Immune cell profiling of COVID-19 patients in the recovery stage by single-cell sequencing
發(fā)表期刊：Cell Discovery(IF:10.8)
發(fā)表年份：2021-05-04

摘要

背景：COVID-2019冠狀病毒的關鍵免疫細胞亞群變化及其狀態(tài)尚不清楚。
方法：在COVID-19患者早期恢復期階段(early recovery stage (ERS))，采用單細胞組學技術，對病人的外周血單個核細胞 (peripheral blood mononuclear cells) 進行轉錄組測序并分析。
結果：COVID-19患者ERS階段，T細胞明顯減少，而單核細胞增多。具體來說，在ERS階段，炎癥相關基因表達的經(jīng)典CD14++單核細胞比例增加，CD14+IL1β+單核細胞的比例也是如此。而CD4+T細胞和CD8+T細胞顯著減少，并且其炎癥相關基因表達量較高。在B細胞中，漿細胞顯著增加，而naive B細胞減少。

實驗設計及質(zhì)控

樣本來源：15個樣本，包括5個早期恢復階段(ERS, early recovery stage)的COVID-19病人，5個晚期恢復階段(LRS, late recovery stage)的COVID-19病人和5個健康對照組(HC, healthy control)的外周血標本。
那么是如何定義ERS和LRS的呢？在mehods有提到，ERS組病人定義為檢出該病人第1次核酸陽性后，其后續(xù)轉陰時間少于7天。LRS定義為定義為該病人第1次核酸陽性后，其后續(xù)轉陰時間超過14天。
標本處理：15個外周血標本，經(jīng)過密度離心后，提取單個核細胞。每個樣本的細胞存活率都大于80%。
細胞過濾標準： gene number between 200 and 7000。過濾后，剩下128096個細胞(13092/10035/13624/8329/12158 cells for HCs; 5163/7685/7171/10058/6581 cells for ERS; 3242/7895/7487/7164/8412 cells for LRS) 進入下游分析。

結果

1.總體免疫細胞表達譜

先聚類注釋，根據(jù)經(jīng)典marker, 初分為髓系細胞、B細胞，NK細胞和T細胞，3種大類細胞(Figure 1c-d)。
Figure 1c

Figure 1d

2.COV2019患者血液中NK和T細胞、B細胞、髓系細胞表達譜

接著分析128096個細胞，包括15個樣本的36442個髓系細胞、64247個NK和T細胞，以及10177個B細胞(Figure 2a)。
Figure 2a

發(fā)現(xiàn)COVID-19患者中，ERS和LRS的患者，髓系細胞比例高于HCS，但NK和T細胞比例較低(Figure 2c-d)。LRS患者的B細胞、NK細胞和T細胞比例比ERS患者多，但髓樣細胞較少。結論是COVID-19患者患者淋巴細胞計數(shù)減少，外周血中髓系細胞計數(shù)增加。
Figure 2c-d
接著對HCs和COVID-19患者的NK和T、B細胞、髓系細胞的基因進行差異分析，發(fā)現(xiàn)COVID-19患者的NK&T和B細胞中的炎癥細胞因子和趨化因子基因，例如IL1B、CCL3、IRF1、DUSP1、JUN和FOS高水平表達，而髓樣細胞未觀察到這種差異(Figure 2d-f)。
Figure 2d-f

3.恢復期COVID-19患者的髓系細胞亞群及其狀態(tài)變化

將髓系細胞分為6群：Classical CD14++ monocytes (M1), non-classical CD16++ (FCGR3A) CD14?/+ monocytes (M2), intermediate CD14++ CD16+ monocytes (M3), CD1C+ cDC2 (M4), CLEC9A+ cDC1 (M5), and pDC (CLEC4C+CD123+) (M6) (Figure 3a-b)。
Figure 3a-b

他們發(fā)現(xiàn)，在髓系細胞中，與HSs對比，ERS患者的Classical CD14++ monocytes （M1）比例較高于HCs患者，而LRS患者則未見差異(Figure 3c).
Figure 3c
與HCs對比，患者的CD14++IL1β+單核細胞和IFN活化單核細胞的豐度較大。與HCs對比，COVID-19患者的CD14++ inflammatory monocytes (M1) 表達較高水平的inflammatory基因，如IL1β、JUN、FOS、JUNB和KLF6和趨化因子、CCL4、CXCR4，還有干擾素刺激基因IFRD1、IRF1和FI6。相反，COVID-19患者的 CD14++ monocytes (M1) 中的anti-inflammatory基因則低表達(Figure 3d-e)。
Figure 3d-e
值得注意的是，IL1β在ERS組中上調(diào)，在LRS組下調(diào)(Figure 3f)。這些結果提示，在COVID-19患者中，細胞因子激活驅動了單核細胞群擴增（尤其是 CD14++ inflammatory monocytes cell)
Figure 3f

COVID-19患者的CD14+單核細胞，上調(diào)的基因主要富集在細胞因子信號傳導和炎癥激活相關的通路，這些通路主要參與基因是IFITM3，IFI6，IL1β、JUN、FOS、JUNB和KLF6(Figure 3g)?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明ERS患者單核細胞群的平衡失調(diào)表現(xiàn)為Classical CD14++ monocytes (M1)顯著增加。在SARS-CoV-2感染期間，Classical CD14++ monocytes (M1)在外周循環(huán)中增加，從而加劇炎癥。
Figure 3g

4.COVID-19患者外周血T細胞和NK細胞的特征

T and NK lymphocytes可被分為10個亞群(Figure 4a-b)。
Fe 4a-b

T&NK細胞亞群組成在HSc和COVID-19兩組中，有明顯差異(Figure 4c)?？偟膩碚f，COVID-19患者中CD8+T細胞(尤其是effector memory CD8+ T cell)和NK細胞的數(shù)量減少，但ERS患者的NK細胞相對比例高于HCS。CD4+T細胞總體比例變化不大，COVID-19患者中central memory CD4+ T cell比例明顯較高，而na?ve CD4+ T cells, Tregs and effector memory CD4+?T cell比例較低，這種現(xiàn)在是ERS組更明顯。
Figure 4c
COVID-19患者中的 CD4+ T cells有較高水平的inflammation-related genes。ERS組病人中，表達較高的FOS, JUN, KLF6, and S100A8。COVID-19患者的CD4+T細胞中，anti-inflammatory則下調(diào)(Figure 4d-e)。這表明CD4+T細胞是病毒感染的主要參與者。
Figure 4d-e

COVID-19患者的CD4+T細胞中，上調(diào)基因富集通路中，含有較多細胞因子途徑和炎癥激活相關的基因，包括IFITM3和IFI6、IL1B、JUN、FOS、JUNB和KLF6(Figure 4f)。
Figure 4f

接著做了TCR-seq 分析。TCR-seq分析顯示，ERS組的T細胞擴增水平明顯低于HC組(Figure 4g).此外，na?ve or central memory T細胞幾乎沒有克隆性擴增，而effector memory T cells, terminal effector CD8+ T cells (CTLs), and proliferating T cells的擴增水平更高。此外，與HCs相比，擴增克隆的CD8+CTL也表現(xiàn)出過度激活的炎癥和抗病毒活性(Figure 4h-i)。


Figure 4g

5.COVID-19患者外周血B細胞的特征

B細胞可分為4群，na?ve B cells，memory B cells， immature B cells 和 plasma cells(Figure 5a-b)。
Figure 5a-b

與HCs患者相比，COVID-19患者漿細胞比例顯著較高，na?ve B cells比例下降(Figure 5c)。Memory B cells and plasma cells (MPB)協(xié)同并誘導特異性抗體產(chǎn)生， 可能在控制病毒感染和適應性免疫中發(fā)揮重要作用。B細胞活化相關基因，例如S100A8、IGLL5、SSR3、IGHA1、XBP1和MZB1，主要表達在ERS組的MPB中(Figure 5d)。接著將COVID-19患者的每個B細胞亞群的炎癥基因的平均值與HCs組進行比較(Figure 5e)，顯示COVID-19患者的B細胞反應和抗體分泌功能增強。
Figure 5c-e
COVID-19患者的B細胞增殖能力和病毒轉錄水平增強，表現(xiàn)為HAG1、XBP1、MZB1、Jun、POLR2L和ZFP36表達增高(Figure 5f)。與HCs相比，COVID-19患者IgA同種型的表達量過多(Figure 5g)。這與血清中IgA水平升高相對應此外，ERS患者（IgA+IgG+IgE）與（IgD+IgM）的比率顯著增加，并隨著恢復時間呈下降趨勢(Figure 5h).
Figure 5f-h

最后做了個BCR，發(fā)現(xiàn)memory B cells幾乎沒有克隆擴增，而CD27+CD38+ memory B cells在不同的B細胞亞群中表現(xiàn)出最高的擴增水平(Figure 6a).與HCs比，Covid-19患者的細胞克隆擴增較多，提示SARS COV-2感染下B細胞經(jīng)歷獨特的VDJ重排。與LRS患者相比，ERS患者的B細胞克隆擴增較高(Figure 6b)。此外，對每個個體來說，ERS組中最大克隆的比率高于HCs組(Figure 6c)。
Figure 6a-c

為了解發(fā)生克隆擴增的B細胞的功能狀態(tài)，將克隆記憶B細胞和其他B細胞之間進行了差異基因分析。結果顯示，克隆擴增的B細胞基因表達增加，包括CD27、SSR4、IGHG1、MZB1和XBP1。隨著病程的推移，LRS患者中擴增B細胞的差異基因數(shù)目顯著減少（Figure 6d）。
Figure 6d
接著發(fā)現(xiàn)與HCs比，Covid-19患者的IGHV3家族基因過度表達，尤其是IGV3-7、IGV3-15、IGV3-21、IGV3-23和IGV3-30（Figure 6e）
Figure 6e
ERS患者配對頻率較高的是IGHV3-23-IGHJ4和IGHV3-7-IGHJ6(Figure 6f)。
Figure 6f

Covid-19患者免疫細胞的細胞通訊

B細胞-單核細胞和B細胞-T細胞的相互作用提示B細胞可以分泌大量IL-6、LTA和LTB，它們與單核細胞中表達的IL-6R、LTAR和LTBR結合，并將大量IL-6作用于T細胞，并促進IFN-γ、IL-1β和其他炎性細胞因子和趨化因子的分泌。因此，ERS組患者中，高表達IL-6的炎性單核細胞及其子代形成級聯(lián)信號(Figure 7c)。在LRS中，DC產(chǎn)生IL-18、TNFSF13和TNFSF13B，以促進B細胞的增殖，向血液中分泌許多抗體。從DC-T和T細胞-B細胞的相互作用中，發(fā)現(xiàn)DC不僅產(chǎn)生IL-18，還產(chǎn)生IL-7以促進T細胞的增殖；此外，T細胞產(chǎn)生IL-2以促進B細胞的增殖和抗體產(chǎn)生(Figure 7d)。
Figure 7c-d

討論

關于討論比較長，我挑了一些簡單的講。
1.文中發(fā)現(xiàn)ERS患者中出現(xiàn)了炎癥反應，這也許可以解釋為什么一些患者在出院后生病，并建議應該重新評估目前的出院標準。
2.文中發(fā)現(xiàn)幾個COVID-19感染特有的位點，配對頻率最高的是IGHV3-23-IGHJ4，這尚未被報道過。目前已有多個類似的位點與病毒相關，例如IGHV3-30 和 IGKV3-11可參與編碼一抗中和人巨細胞病毒。IGHV3-30和IGHV3-21已被用于分離流感病毒抗體，并用于生產(chǎn)病毒疫苗。此外，結合 IGHV3-15/IGLV1-40 片段的抗體對埃博拉病毒具有很好的中和活性。

結論

總之，該研究提供了第一份COVID2019患者康復出院后出現(xiàn)適應性免疫失調(diào)現(xiàn)象的免疫細胞圖譜，對較大隊列中康復患者的縱向研究可能有助于了解疾病的后果。本研究下確定的新BCR可能會促進我們對B細胞機制的理解，并在COVID-19免疫療法中具有潛在的臨床應用。

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