2019年，接連3篇高水平染色體外環(huán)狀DNA的研究論文引爆了這一幾十年前就已發(fā)現(xiàn)的一種存在于染色體外的DNA形式的研究熱潮。當(dāng)然，不僅僅文章的發(fā)表，這一研究方向能夠得到如此多的關(guān)注也是因?yàn)楦咄繙y(cè)序技術(shù)的應(yīng)用使得對(duì)eccDNA的作用感興趣的研究人員有了更加便捷的研究方法，降低了研究的門檻。
一、eccDNA的研究歷程
首先，我們來(lái)看什么是環(huán)狀DNA。環(huán)狀DNA是一種生物界普遍存在的DNA形式，如常見(jiàn)的線粒體DNA、葉綠體DNA、細(xì)菌基因組、細(xì)菌質(zhì)粒、部分病毒基因組等。那么本文要討論的染色體外環(huán)狀DNA同上述提到的幾種形式有什么不同呢？我們都知道線粒體DNA和質(zhì)粒的都是以線性的DNA的形式存在的，其染色質(zhì)成分并沒(méi)有組蛋白，因而也不存在核小體的結(jié)構(gòu)，并且不會(huì)發(fā)生染色體序列的折疊和三級(jí)結(jié)構(gòu)。而eccDNA，既然叫做染色體外環(huán)狀DNA，那么它首先應(yīng)該是存在于真核生物當(dāng)中的（原核生物、細(xì)胞器、病毒等不存在染色體的結(jié)構(gòu)），其次必須是以環(huán)狀的形式存在的，再者是游離于染色體外的，并且具有完整的核小體結(jié)構(gòu)，也就是說(shuō)，其染色質(zhì)的組成是與正常的染色體相同的，因而也具有染色質(zhì)折疊、壓縮和特有的空間結(jié)構(gòu)。
染色外環(huán)狀DNA早在1965年就已經(jīng)被報(bào)道，這是首次在小麥胚乳細(xì)胞和豬精子當(dāng)中發(fā)現(xiàn)的DNA存在形式。
同年其他研究人員報(bào)道在人的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了eccDNA，并且發(fā)現(xiàn)是都是以成對(duì)的形式存在，因此被稱作“雙微體”，這也是雙微體概念的首次提出。(大家注意一下下圖中染色體旁邊成對(duì)出現(xiàn)的小黑點(diǎn)就是雙微體)
接著陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)雙微體中能夠攜帶癌癥基因，如EGFR和MYC基因通過(guò)eccDNA在腫瘤細(xì)胞中擴(kuò)增了40%（Cancer Genetics and Cytogenetics, 2008）；在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞通過(guò)形成eccDNA造成攜帶的EGFR和MYC基因大量擴(kuò)增(PNAS, 2014)。
盡管諸多研究成果都是基于雙微體研究來(lái)進(jìn)行的，但是事實(shí)上，后續(xù)研究證明并非所有的eccDNA都是以雙微體的形式存在的。2017年，Nature發(fā)表了一篇首次利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)17個(gè)腫瘤樣本的大規(guī)模eccDNA研究，發(fā)現(xiàn)只有~30%的eccDNA是以雙微體的形式存在的。同時(shí)也證明不同eccDNA在不同的腫瘤樣本中是普遍存在的，但是含量有很大差別。
可以說(shuō)從2017年的這篇文章起，eccDNA的研究真正進(jìn)入的高通量測(cè)序時(shí)代。目前為止主要包含以下幾篇文章：
2017年：Nature，17種腫瘤的2572種細(xì)胞系的全基因組測(cè)序分析，證明eccDNA在腫瘤組織中普遍存在；
2018年：Nature Communications，健康人的肌肉和血液細(xì)胞中分離到超過(guò)十萬(wàn)種eccDNA分析，它們絕大部分都攜帶基因或基因片段，證明eccDNA在正常組織中是普遍存在的；
2019年：Nature Genetics, eccDNA驅(qū)動(dòng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤基因組重塑；
2019年：Nature，eccDNA促進(jìn)染色質(zhì)可接近性和致癌基因的高表達(dá)；
2019年：Cell，功能性增強(qiáng)子自造成染色體外癌基因的擴(kuò)增；
二、eccDNA可能的形成機(jī)制
eccDNA究竟是如何形成的，目前尚沒(méi)有十分確切的解釋，目前推測(cè)的可能機(jī)制包括以下幾種：（A）DNA復(fù)制過(guò)程中，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，接著在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)滑動(dòng)形成環(huán)狀，并從染色體中切割下來(lái)并復(fù)制形成雙鏈環(huán)狀DNA，這種形成方式的特點(diǎn)是染色體原始位置上的這段序列發(fā)生了缺失；（B）DNA復(fù)制時(shí)形成R-loop結(jié)構(gòu)，在這種結(jié)構(gòu)中，其中一條鏈發(fā)生折疊，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并切割下來(lái)，形成環(huán)狀DNA，發(fā)生斷裂的雙鏈通過(guò)DNA的損傷修復(fù)機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)齊，因此這種方式不會(huì)造成染色體原始序列的損傷；（C）通過(guò)DOIRA模型，通過(guò)雙鏈復(fù)制的方式形成；也不會(huì)造成原始序列損傷；（D）通過(guò)雙鏈的同源區(qū)域的重組，造成雙鏈同時(shí)斷裂，往往通過(guò)這種方式會(huì)產(chǎn)生Mb以上的較大的eccDNA，并且原始序列會(huì)發(fā)生缺失。
所以，總的來(lái)說(shuō)，eccDNA的形成是依賴于DNA的序列特征、復(fù)制過(guò)程和DNA損傷的修復(fù)的。從目前已有的研究進(jìn)展來(lái)看，就序列特征而言，串聯(lián)重復(fù)序列會(huì)更容易造成eccDNA的形成；并且大部分的eccDNA有段重復(fù)序列，但是也有相當(dāng)?shù)牟糠譀](méi)有重復(fù)序列，不能與任何附近的序列發(fā)生重組；高GC、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，像R-loop形成和修復(fù)促進(jìn)eccDNA的形成；同源重組會(huì)切除重復(fù)DNA產(chǎn)生序列更大的eccDNA。而就DNA損傷修復(fù)而言，研究發(fā)現(xiàn)致癌物會(huì)提高eccDNA的水平，同時(shí)一些特異的DNA損傷修復(fù)蛋白是eccDNA形成所必需的，但是還有一些是非必需的。最后，雖然我們?cè)谏鲜鰁ccDNA推測(cè)的形成機(jī)制中提到的大多是與DNA復(fù)制有關(guān)的，但事實(shí)上，不發(fā)生DNA復(fù)制的情況下，eccDNA也可以存在。所以說(shuō)，eccDNA的形成并不是一個(gè)簡(jiǎn)單過(guò)程，而是可能由多種因子，多種蛋白，并且有一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制參與的過(guò)程，具有很重要的生物學(xué)功能。
三、eccDNA的大小和類型
eccDNA的大小從幾百bp到幾十Mb不等，其中較小的一種是2012年Science報(bào)道的被稱作MicroDNA的特殊的eccDNA，大小只有200-400bp，有片段過(guò)短，因此不能攜帶完整的基因序列；但是目前MicroDNA被認(rèn)為具有一些重要的調(diào)節(jié)功能，包括調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，或者通過(guò)分子海綿的作用調(diào)控一些非編碼RNA的表達(dá)，同時(shí)這種DNA也被認(rèn)為是可能在未來(lái)應(yīng)用于液體活檢來(lái)監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)生發(fā)展的一種體外游離DNA的形式。雙微體形式存在的eccDNA一般較大，100kb-3Mb等，很多可以在光學(xué)顯微鏡下被觀察到，能夠攜帶一些完整的基因結(jié)構(gòu)和上游的調(diào)控序列。那么類似雙微體或非雙微體形式存在的這種大型的eccDNA形式也是最有可能攜帶完整功能基因結(jié)構(gòu)的，被關(guān)注最多的，也是相對(duì)更容易開(kāi)展后續(xù)研究的形式。
四、eccDNA的功能
eccDNA目前已經(jīng)有很多的功能被證實(shí)，包括介導(dǎo)細(xì)胞的衰老，如上表中的rDNA circle，被證明在酵母細(xì)胞衰老過(guò)程中發(fā)揮作用；基因補(bǔ)償效應(yīng)在組蛋白H2A-H2B的編碼基因研究中被發(fā)現(xiàn)，敲除后會(huì)造成eccDNA中的同源基因顯著擴(kuò)增；腫瘤的適應(yīng)性進(jìn)化和異質(zhì)性在2019年的幾篇文章中都有報(bào)道；抗藥性早在1978年就已經(jīng)證實(shí)攜帶DHRF基因的雙微體會(huì)造成小鼠細(xì)胞的氨甲喋呤耐藥，2014年一篇研究發(fā)現(xiàn)eccDNA中的EGFR基因突變會(huì)造成膠質(zhì)瘤的耐藥性（Science, 2014）。
關(guān)于細(xì)胞間異質(zhì)性的推測(cè)主要是因?yàn)閑ccDNA中沒(méi)有著絲粒的結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞發(fā)生有絲分裂時(shí)會(huì)隨機(jī)分配到子代細(xì)胞中。但是在細(xì)胞準(zhǔn)備發(fā)生分裂時(shí)，是否會(huì)有專門的機(jī)制調(diào)控eccDNA提前進(jìn)行復(fù)制后分配，沒(méi)有看到相關(guān)的研究報(bào)道。
在eccDNA的隨機(jī)分配后，獲得有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的eccDNA會(huì)保持生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，這或許是腫瘤組織內(nèi)異質(zhì)性和原發(fā)癌/轉(zhuǎn)移癌中異質(zhì)性發(fā)生的機(jī)制之一。但是目前尚沒(méi)有實(shí)現(xiàn)從單細(xì)胞層面檢測(cè)eccDNA的方法，所以細(xì)胞間異質(zhì)性和互作還難以實(shí)現(xiàn)，其他方面的研究也還沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道出來(lái)。
五、eccDNA的分析方法
目前已經(jīng)報(bào)道的基于高通量測(cè)序方法研究eccDNA的報(bào)道都是基于Paul S. Mischel團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的AmpliconArchitect軟件，基于二代全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)（5-10X覆蓋深度），該軟件可自動(dòng)比對(duì)基因組，尋找斷點(diǎn)信息，并結(jié)合SV和CNV的分析結(jié)果生成eccDNA的分析結(jié)果。不過(guò)需要注意的是，目前該軟件的license是收費(fèi)的。
不過(guò)還可以考慮通過(guò)提取環(huán)狀DNA和滾環(huán)擴(kuò)增的方式獲得eccDNA，并進(jìn)行后續(xù)的測(cè)序和組裝，這時(shí)候相對(duì)于對(duì)軟件依賴的限制就相對(duì)較小了，但是對(duì)于線性DNA背景的排除依然是個(gè)問(wèn)題，在基因組DNA的提取、擴(kuò)增、質(zhì)控及后續(xù)分析方面還需要諸多探索。
「2020年04月12日 ·北京」
