當(dāng)我們做轉(zhuǎn)染實驗的時候，總會遇到一些難轉(zhuǎn)染的細胞。恰巧課題組研究的是原代細胞、神經(jīng)細胞或者是免疫細胞，化學(xué)轉(zhuǎn)染方法反復(fù)試驗失敗，這時候就得借助電轉(zhuǎn)來幫助我們推進實驗進程了。
對于貼壁細胞和懸浮細胞，在電轉(zhuǎn)前需要進行不同的處理。
貼壁細胞
電穿孔前一天，通過胰酶消化釋放貼壁細胞，將細胞轉(zhuǎn)移到含新鮮生長培養(yǎng)基的75cm2細胞瓶中，接種密度應(yīng)保證電穿孔當(dāng)天細胞能夠達到50%~70％的匯合度（多數(shù)細胞系為每次電穿孔1 X 105~ 10 X105細胞）。
實驗當(dāng)天，吸出生長培養(yǎng)基， PBS 洗滌細胞，胰酶消化釋放貼壁細胞。取胰酶消化的細胞懸液，用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞密度。細胞懸液于室溫下500g 離心5min 。
用適當(dāng)?shù)碾姶┛拙彌_液按1 X 106~ 5 X 106細胞／mL 的密度重懸細胞沉淀。輕輕吹打細胞獲得均一懸液。
懸浮細胞
電穿孔前一天，于75cm2細胞瓶中用新鮮生長培養(yǎng)基稀釋細胞， 以保證電穿孔當(dāng)天細胞能夠達到指數(shù)生長中期的匯合度( 0. 5 X 106~4 X 106個細胞／mL ) 。計數(shù)細胞并按上述離心收集細胞。
用適當(dāng)?shù)碾姶┛拙彌_液按1 X 106~5 X 106個細胞／mL 的密度重懸細胞沉淀。輕輕吹打細胞獲得均一懸液。
電穿孔操作步驟
1. 在電穿孔儀器上設(shè)置參數(shù)。根據(jù)細胞類型選擇預(yù)設(shè)程序或優(yōu)化程序。對于指數(shù)程序（即指數(shù)衰減脈沖） ， 通常電容為1050μF , 電壓在200 ~ 350V 。一般260V 起始電壓、以50V遞增對大多數(shù)細胞有效。內(nèi)部阻抗設(shè)為無限大。
2.向電穿孔杯中加入10 ~ 50μg 質(zhì)粒DNA 。如有必要， 可加入運載DNA，使DNA 總量達到120μg 。
3.向電穿孔杯中加入細胞，輕輕反復(fù)吹打使細胞和DNA 混勻。
4.將電穿孔杯放進電穿孔儀，蓋上蓋子，進行一次電脈沖。
5.立即向電穿孔杯中加入0.5mL 生長培養(yǎng)基，然后將電擊后的細胞轉(zhuǎn)移到合適大小的組織培養(yǎng)皿或多孔板中。如有必要， 用生長培養(yǎng)基漂洗0.2cm 或0.4cm 電穿孔杯，然后將漂洗液加到培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板內(nèi)的細胞中。
6.對每個樣品和每個電壓增量均重復(fù)步驟5和步驟6 。記錄每個電穿孔杯的實際脈沖時間和時間常數(shù)以便于各次實驗間的比較。對于哺乳動物細胞，最適條件是場強為400 ~900V/cm、脈沖時間或時間常數(shù)為10 ~ 40ms 。輕輕晃動平板以使細胞均勻分布于整個孔或培養(yǎng)皿。
7.將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板放到含5 %~ 7% CO2的37°C 濕潤保溫箱中培養(yǎng)細胞6 ~ 24h 。
8.檢測細胞活力。
9.如要分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體，可按分離步驟操作。
10.對于瞬時表達，于電穿孔后24 ~96h對細胞進行檢測。
同時，電穿孔效率受以下幾種因素的影響：
1.外加電場的強度。電壓過低，培養(yǎng)細胞質(zhì)膜的改變不足以允許DNA 通過；電壓過高，細胞會受到不可逆的損傷。對于大多數(shù)哺乳動物細胞系， 電壓250~ 500V/cm時可達到最高瞬時表達水平。通常經(jīng)過電穿孔， 20% ～ 50％的細胞能夠存活（根據(jù)臺盼藍拒染法的檢測結(jié)果）。
2.電脈沖時間的長短。通常對細胞進行單次電脈沖。電脈沖的持續(xù)時間、電場形狀和強度由電源容量及電穿孔杯尺寸決定。多數(shù)電穿孔裝置允許研究者控制脈沖參數(shù)，電穿孔儀有指數(shù)衰減波和方形波兩種電脈沖形狀可供選擇。
3.溫度。有些研究者報道， 電穿孔過程中將細胞維持在室溫時瞬時表達水平最高；而有的將細胞保持在0 °C 獲得了更好的結(jié)果。造成以上差異的原因可能是細胞類型不同或電穿孔過程中產(chǎn)熱量不同， 較高電壓（大于1000V/cm)、較長時間電脈沖（大于l00ms) 的情況容易產(chǎn)生較多的熱量。電脈沖處理后再將細胞于電穿孔室內(nèi)孵育l ~2min 可提高瞬時表達效率 。
4.DNA 的構(gòu)象與濃度。雖然線性和環(huán)狀DNA 均能夠通過電穿孔進行轉(zhuǎn)染，但采用線性DNA 進行瞬時表達和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水平均更高些 。采用1 ~40μg/mL 濃度的DNA 可獲得高效的轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒純度也是影響電穿孔效率的重要因素。
5.培養(yǎng)基的離子成分。用緩沖鹽溶液（如HEPES 鹽緩沖液）懸浮細胞，轉(zhuǎn)染效率比用含甘露糖或蔗糖等非離子物質(zhì)的緩沖液高數(shù)倍。
6.細胞的生理狀態(tài)。生長活躍、狀態(tài)健康、無污染、最好低代次的細胞可獲得最佳轉(zhuǎn)染效果。
