Knock in
后期要用到KI技術，現(xiàn)在先敲入一個熒光練手
目標
細胞：HEK293細胞
基因：GAPDH基因 改為ActB（原因見下）
選擇標記：mNeonGreen（原因見下）
設計流程&實驗流程
選定靶標基因
選擇Cas9靶標區(qū)段
設計Cas9 sgRNA
合成sgRNA載體（含cas9）
設計供體載體
構建供體載體
設想進化
兩株細胞GAPDH基因C端分別敲入Linker-3*FLAG-TGA和Linker-mNeon-TGA，用于IP和成像
一株細胞GAPDH基因C端同時敲入Linker-3*FLAG-loxp-mNeon-TGA-loxp，用于成像同時可以Cre切割loxP用于IP
一株細胞GAPDH基因C端敲入Linker-lox71-3*FLAG-Linker-mNeon-TGA-lox2272，方便使用RMCE在高效lox序列間替換所需標簽
一株細胞GAPDH基因C端最后一個內含子中敲入lox71-Intron-Exon-Linker-mNeon-TGA-lox2272，減少lox序列對氨基酸的影響，donor使用loxP+lox2272
一株細胞Actin基因C端最后一個內含子中敲入lox71-Intron-Exon-Linker-mNeon-TGA-lox2272。反正都是測試，actin說不定還能看絲狀結構何樂不為
一株細胞Actin基因C端最后一個替換為人工內含子，敲入lox71-Intron-Exon-Linker-mNeon-TGA-lox2272。多個sgRNA靶向該內含子，而每個sgRNA都要在相應的donor上把Cas9靶位點沉默掉。構建多個突變質粒過于繁瑣，索性改為不含Cas9靶位點的人工內含子。一次質粒構建，多次使用。
供體載體
1. 使用兩端各含有800-1000bp同源臂的質粒作為donor。效率低但是方便通用
2. 使用兩端各含有500bp同源臂+sgRNA靶位點的質粒作為donor。切割釋放donor片段提高編輯效率(但是不方便用一個donor對應多個sgRNA，相當于每個sgRNA都要配套的donor質粒)
涉及到的額外知識點
sgRNA選擇
兩篇論文使用機器學習得到高效sgRNA設計規(guī)律，直接使用預測結果即可。
http://deepcrispr.info/DeepSpCas9variants/
http://www.deephf.com/index/#/Predict
熒光蛋白選擇
根據(jù)熒光蛋白數(shù)據(jù)庫(https://www.fpbase.org/table/)按亮度篩選單體熒光蛋白
選擇mNeonGreen，因為亮度強(92.8)、分子小、手上有。
相對之下常用的EGFP亮度弱(33.5)，還有弱二聚體傾向(weak dimer)。
內含子知識點
本例中ActB內含子分析
參考
http://what-when-how.com/molecular-biology/splice-sites-molecular-biology/
https://en.wikipedia.org/wiki/RNA_splicing
https://www.fpbase.org/table/
Lambert, TJ (2019) FPbase: a community-editable fluorescent protein database.?Nature Methods.?16, 277–278. doi:?10.1038/s41592-019-0352-8
