hello，又到周五，一周的收官之戰(zhàn)，今天我們要繼續(xù)分享單細胞空間聯(lián)合分析的文章，參考文章在Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level，2021年8月發(fā)表于cancer discovery,IF17.40分，我們來看一下這一次運用單細胞空間聯(lián)合技術(shù)給我們帶來什么不一樣的生物學(xué)分析內(nèi)容。

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ABSTRACT

肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌死亡的主要原因，表現(xiàn)出高度異質(zhì)性和抑制性的免疫微環(huán)境。 在這里，使用 single-cell RNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)對 97 個匹配的樣本進行了測序。 Strikingly，轉(zhuǎn)移性微環(huán)境經(jīng)歷了免疫抑制細胞（如 MRC1⁺ CCL18⁺ M2 樣巨噬細胞）的顯著空間重編程。 進一步開發(fā)了 scMetabolism，這是一種用于量化單細胞代謝的計算pipeline（這個值得大家注意一下），并觀察到這些巨噬細胞具有增強的代謝活性。 有趣的是，新輔助化療可以阻斷這種狀態(tài)并恢復(fù)反應(yīng)性患者的抗腫瘤免疫平衡，而無反應(yīng)性患者則惡化為更具抑制性的狀態(tài)。 研究的工作描述了轉(zhuǎn)移的免疫進化，并揭示了腫瘤如何對新輔助化療作出反應(yīng)的black box。

STATEMENT OF SIGNIFICANCE

We present a single-cell and spatial atlas of colorectal liver metastasis and found the highly metabolically activated MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in metastatic sites. Efficient neoadjuvant chemotherapy can slow down such metabolic activation, raising the possibility to target metabolism pathways in metastasis.（解析了結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移的單細胞和空間圖譜，并在轉(zhuǎn)移部位發(fā)現(xiàn)了高度代謝激活的 MRC1⁺ CCL18⁺ M2 樣巨噬細胞。 有效的新輔助化療可以減緩這種代謝激活，提高靶向轉(zhuǎn)移代謝途徑的可能性）。

INTRODUCTION

Liver metastasis（肝轉(zhuǎn)移） remains a major hurdle to long-lasting survival of colorectal cancer（結(jié)腸癌） patients, which can be partly explained by the highly dynamic spreading routes of cancer cells（癌細胞的高度動態(tài)spreading routes ）. Outside the cancer cells, tumor microenvironment (TME) of liver metastasis harbors a highly immunosuppressive phenotype, induces a systemic loss of antigen-specific T lymphocytes, and drives the spread of tumor（免疫細胞失去其功能也是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的一個推手）. It still remains largely unknown how the immune cells spatially orchestrate Colorectal Cancer Liver Metastasis (CRLM) progression and whether the metastatic cellular microenvironment differs from the primary ones（看來很多生物學(xué)問題必須要借助單細胞空間的聯(lián)合技術(shù)）. There is hence a pressing need for recording, identifying, and quantifying cellular or even spatial landscape of CRLM to refresh our understanding of metastasis biology.

Neoadjuvant Chemotherapy (NAC，新輔助化療) refers to that chemical drugs are administered prior to surgical removal of a tumor（在手術(shù)切除腫瘤之前施用化學(xué)藥物）. Paradoxical results（矛盾的結(jié)果） have been seen for the effect of NAC in CRLM. In some reports, NAC was shown to prolong the progression-free survival and overall survival. However, especially in the low-risk resectable CRLM patients, NAC was unexpectedly associated with an unimproved overall survival（看來腫瘤異質(zhì)性對藥物的反應(yīng)是不同的）. Another independent group also reported that NAC did not prolong disease-free interval. Those seemingly contradictory data raise a critical but poorly understood question whether NAC could favor anti-tumor response and improve outcome of CRLM patients. Thus, dissecting the precise effect of NAC, especially tumor microenvironment alterations, is crucial for understanding the key mechanisms of NAC and designing novel therapeutic strategies（目前單細胞技術(shù)無法臨床運用的關(guān)鍵就在于此吧）。

Here, using single-cell RNA-seq (scRNA-seq) and Spatial Transcriptomics (ST) of 97 samples from 24 patients（單細胞空間聯(lián)合的技術(shù)）, we aim to explore the immune atlas of CRLM. We revealed that immune microenvironment showed dynamic cellular and spatial changes from primary to metastatic sites（免疫細胞的特征以及空間動態(tài)）. Following NAC treatment, the immune phenotypes underwent antitumor remodelling in responsive patients but shifted towards more immunosuppression in non-responsive patients, where the immunosuppressive cells were reprogrammed at metastatic sites（免疫細胞經(jīng)歷了重編程）. Our findings highlight the favorable effect of efficient NAC treatment in resectable CRLM patients and allow for the data-driven design of novel therapeutic combinations such as NAC plus immunotherapy in selected patients（可以指導(dǎo)臨床運用，這個肯定是未來的方向)。

RESULTS

Integrated scRNA-seq and Spatial Transcriptomics Precisely Quantify Immune Cell Diversity in Resectable CRLM

為了定義 CRLM 的single-cell landscape，應(yīng)用 scRNA-seq 和 ST 來量化 CD45⁺ 細胞動態(tài)，使用結(jié)直腸癌 (CRC)、鄰近結(jié)腸、肝轉(zhuǎn)移 (LM) 和鄰近肝臟、結(jié)腸淋巴結(jié) (LN) 和外周血單核細胞 (PBMC) 的配對樣本。 根據(jù)嚴格的標準，總共recruited了 24 名可切除的 CRLM 患者。 如前所述，腫瘤的可切除性都通過了由資深臨床醫(yī)生組成的多學(xué)科團隊討論。 具體而言，20名患者的89份樣本進行了scRNA-seq，4名患者的8份樣本進行了ST測序，其中13名患者的54份樣本未接受治療，6名患者的30份樣本接受部分緩解的新輔助化療（PR )，來自 5 名患者的 13 個樣本接受了疾病進展 (PD) 或疾病穩(wěn)定 (SD) 的新輔助化療。 所有腫瘤都是microsatellite stable。

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• 注：The experimental scheme for discovering and validating functional immune subpopulations in CRLM.

After two rounds of quality control and doublet removal of scRNA-seq data, 79,703 cells from untreated patients (n = 11), 36,284 cells from NAC PD/SD patients (n = 5), and 62,643 cells from NAC PR patients (n = 4) were used for further analysis. On average, each sample contained 2,007 cells and 1,064 genes (median) were quantified in each cell, with no obvious batch effects across different samples. We integrated all 178,630 CD45⁺ cells, performed the clustering analysis, and defined the main cell types using the SingleR(SingleR定義細胞類型) and cell marker genes（marker 基因也需要額外驗證）. Largely consistent with previous scRNA-seq of colon cancer, we identified myeloid cells, CD8⁺ T cells, CD4⁺ T cells, NK cells, and B cells from the CRLM samples. Of note, T cell proportion was obviously distinct across different tissue types, suggesting the tissue heterogeneity of the immune microenvironment. Both CRC and paired LM showed ~10% Treg cells of all CD45⁺ cells, while such cells were scarce in the adjacent normal tissues. This indicated an suppressed intratumor immunity, which was previously ascribed to the reduced immunotherapeutic efficacy in liver metastasis. Likewise, we integrated the SingleR and manual marker-based annotation to further define immune cell subsets for further in-depth analysis.

同時，分析了來自 2 名未治療患者和 2 名 NAC PR 患者的 8 個樣本（配對的 CRC 和 LM）的 ST 數(shù)據(jù)。無監(jiān)督聚類分析將樣本分為不同的區(qū)域，例如腫瘤和成纖維細胞區(qū)域。為了整合 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)，我們使用 Seurat 來量化主要免疫亞群。在未經(jīng)處理的樣本中，我們觀察到與 scRNA-seq 一致的免疫細胞模式，例如 CD8⁺ T 細胞在 LM 和 CRC 中的顯著富集。相比之下，在 NAC 處理的樣本中，觀察到較小的腫瘤區(qū)域和免疫細胞的不規(guī)則分布。特別是在 LM 中，只有一小部分斑點聚集在癌細胞中，表明 NAC 治療后細胞區(qū)室的fundamental remodeling?？傊Y(jié)果突出了 CRLM 患者的時空動態(tài)免疫cell landscape和 NAC 后的huge remodeling。(單細胞 CRLM 圖譜現(xiàn)已在線提供，用于探索原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的免疫多樣性 (http://www.cancerdiversity.asia/scCRLM))。

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Metastatic Tumors Are Enriched with Immune Suppressive Cells, Especially MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like Macrophages

鑒于患者的細胞成分異質(zhì)性，利用bias-corrected and accelerated (BCa)bootstrap algorithm來估計細胞比例，該算法使用引導(dǎo)重采樣 1,000 次來估計與細胞類型比例估計相關(guān)的標準誤差。分析過濾了低豐度的免疫細胞，聚集了免疫細胞的比例，并在整個組織中對它們進行了scale。一般來說，在未處理的樣本中，免疫細胞豐度可分為 6 種不同的模式（鄰近結(jié)腸直腸高、CRC 高、鄰近肝臟高、LM 高、結(jié)腸直腸高和肝臟高）。相鄰的結(jié)直腸樣本顯示出最高比例的 AIM2⁺ 記憶 B 細胞、TCL1A⁺ 初始 B 細胞和 CD4⁺ 初始 T 細胞，而 CRC 樣本主要富含 FOXP3⁺ Treg 細胞。 MAIT 細胞、NK 細胞和 FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T 細胞在鄰近的正常肝組織中富集，類似于之前在原發(fā)性肝癌中的報道。這些結(jié)果表明某些免疫細胞的器官特異性分布。有趣的是，PDCD1⁺ CD4⁺ T 細胞和 CTLA4⁺ CD8⁺ T 細胞分別在原發(fā)性腫瘤（CD45⁺ 細胞的 2.24% 和 1.49%）和 LMs（CD45⁺ 細胞的 1.17% 和 3.02%）中相對富集，這與其他計算預(yù)測一致。這些細胞在 TME 中的共存表明對免疫細胞的common tumor education。相比之下，一些免疫抑制細胞特異地存在于 LM 中，其中觀察到 SPP1⁺ 巨噬細胞和 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞的急劇增加。我們query了這種 LM 特異性巨噬細胞的起源，發(fā)現(xiàn)特別是 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞具有Kupffer細胞特征，表明它們可能來自肝Kupffer細胞。據(jù)報道，中性粒細胞具有潛在的促腫瘤作用，在 LM 中也富集。進一步使用 ssGSEA（一種被證明對 ST 數(shù)據(jù)穩(wěn)健的方法）來量化免疫細胞亞群的空間分布。同樣，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和 SPP1⁺ 巨噬細胞在未治療的 LM 中富集。這些數(shù)據(jù)與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)部分一致，進一步證實了肝轉(zhuǎn)移中潛在的抑制性 TME。

接下來，試圖在另外三個獨立的 CRLM cohorts中驗證分析的發(fā)現(xiàn)。首先，使用多重免疫組織化學(xué) (mIHC) 來量化同一醫(yī)院另外 27 名 CRLM 患者（n = 18，未治療；n = 9，NAC-PR）中選定免疫細胞亞群的空間分布。在未處理的樣本中，觀察到 CRC 和 LM 中 FOXP3⁺ Treg 細胞、MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和 SPP1⁺ 巨噬細胞的浸潤顯著增加，這與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)基本一致。其次，利用 ssGSEA 對 CRLM（n = 133）的大量微陣列數(shù)據(jù)集中的免疫細胞進行評分。由于缺乏鄰近組織數(shù)據(jù)，只能檢查原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的細胞豐度。根據(jù)scRNA-seq 數(shù)據(jù)，在該驗證cohorts中，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞、SPP1⁺ 巨噬細胞和中性粒細胞在轉(zhuǎn)移性腫瘤中均顯著升高。第三，在癌癥基因組圖譜 (TCGA) CRC cohorts（n = 430）中探討了 scRNA-seq 定義的免疫細胞亞群的預(yù)后價值。 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和 SPP1⁺ 巨噬細胞在原發(fā)性腫瘤中的高評分均預(yù)示著預(yù)后顯著更差?？偠灾?，CRLM 單細胞和空間免疫landscope可以在獨立的cohorts中得到驗證，表明數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性。這些觀察結(jié)果還假設(shè)特定的巨噬細胞亞群可能在 CRLM 的促腫瘤生態(tài)位形成中發(fā)揮重要作用。

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• 注：Immune Remodeling from Primary Tumor to Liver Metastasis, Especially the MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages. (A) Heatmap showing proportions of immune cell subsets in different tissues. The color represents the scaled cellular proportion. The pattern of immune infiltration can be classified into 6 types, including adjacent colon high, CRC high, adjacent liver high, LM high, colon high, and liver high. (B) The proportions of selected immune cell subsets. The y axis represents the percentage (bootstrap), and x axis represents different tissues. The shaded areas represent the upper quantile and lower quantile bootstrap cell proportions. (C) The spatial transcriptomics of selected immune cell subsets in colon or liver tumor-normal samples. (D) Multiplex immunohistochemistry of FOXP3⁺ Treg cells. The blue arrows represent the FOXP3⁺ Treg cells. (E) Multiplex immunohistochemistry of SPP1⁺ macrophages and MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages. The blue arrows represent the SPP1⁺ macrophages and the yellow arraws represent the MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages. (F) The proportions of SPP1⁺ macrophages, MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages, and FOXP3⁺ Treg cells among all CD45⁺ cells revealed by multiplex immunohistochemistry. The boxplot represents the mean value and the error bar represents the standard error value. **, P < 0.01; **, P < 0.005. P values were determined by Wilcox test. (G) The prognostic value of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in TCGA CRC patients. P values were determined by log-rank test.

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Metastatic Tumor Potentially Educated Macrophages Shift Towards Suppressive Status

鑒于 LM 中巨噬細胞亞群的富集，分析假設(shè)那些富含 LM 的巨噬細胞在不同組織中的功能可能不同。因此，進行了基于配體-受體的癌癥-免疫串?dāng)_分析（細胞通訊），并在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位之間進行了比較。Strikingly，SPP1⁺ 巨噬細胞和 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞在 LM 和 CRC 之間的所有差異串?dāng)_（通訊）細胞類型中排名靠前。這一結(jié)果表明，肝轉(zhuǎn)移癌細胞可能優(yōu)先重編程巨噬細胞并誘導(dǎo)其特定的功能狀態(tài)，這可能是由于原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌細胞之間的內(nèi)在差異。值得注意的是，LM 中的轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞優(yōu)先表達配體 CD47，這是一個重要的“don’t-eat-me”的檢查點，因此可能通過相應(yīng)的受體 SIRPA 招募或激活 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞。進一步利用 mIHC 來可視化這些蛋白質(zhì)，并直接觀察 CD47⁺ 腫瘤細胞和 SIRPA⁺ 巨噬細胞之間的串?dāng)_。這些特別富含 LM 的配體-受體對為靶向治療肝轉(zhuǎn)移提供了線索。
為了查明獨特的腫瘤微環(huán)境imprinted的差異，在 CRC 和 LM 巨噬細胞之間進行了差異基因表達分析。值得注意的是，富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞高度表達了a broad spectrum of key molecules fundamental for macrophage polarization。 APOE作為抗炎和pro-M2轉(zhuǎn)化蛋白，是顯著差異表達的基因之一。其他 M2 極化相關(guān)基因如 MARCO 在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞中也顯著上調(diào)。相比之下，分析發(fā)現(xiàn)富含 CRC 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞表現(xiàn)出更高的炎性細胞因子表達，包括 TNF、IL1B、CCL3 和 CCL4。在 SPP1⁺ 巨噬細胞中也觀察到這種分子譜的變化，表明巨噬細胞具有從原發(fā)部位到轉(zhuǎn)移部位的共同功能變化。然后，通路富集分析顯示來自 CRC 和 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞中代謝通路的強烈富集，突出了代謝在決定這些巨噬細胞功能中的基本作用。值得注意的是，發(fā)現(xiàn) CRC 中的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞富含氧化磷酸化，而它們在 LM 中的對應(yīng)物則以氨基酸代謝為主。這些數(shù)據(jù)強調(diào)，代謝調(diào)節(jié)可能介導(dǎo)巨噬細胞響應(yīng)不同微環(huán)境線索的表型和功能轉(zhuǎn)變。

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• 注：MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages in Metastatic Tumors Exhibited Terminally Differentiated 965 and Suppressive States. (A) The ranked differential tumor-immune cell crosstalk (LM v.s. CRC ) shows MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages ranked the second among all ligand-receptor pairs. (B) The LM upregulated ligand-receptor crosstalk between MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages and SPP1⁺ macrophages with cancer cells (LM v.s. CRC). The y axis represents the ligand & receptor name,while the x axis represents the tissue. The circle size represents the log normalized P-value while the color darkness represents the log-transformed mean expression of ligand & receptor. (C) Multiplex immunohistochemistry shows the crosstalk between tumor cells and MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages or SPP1⁺ macrophages via the ligand-receptor of CD47-SIRPA. (D) The volcano plot represents the differentially expressed genes of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages between CRC and LM. (E) The selected gene expression of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in CRC and LM. ***, P < 0.005. P values were determined by Wilcox test. (F) Pathway enrichment analysis of highly expressed genes of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in CRC and LM respectively. KEGG gene sets were used to perform the pathway enrichment analysis. Only selected pathways were shown.

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scMetabolism: A Computational Pipeline for Quantifying Metabolic Activity Using scRNA-seq Data

以單細胞分辨率挖掘代謝活動仍然具有挑戰(zhàn)性，主要是由于缺乏易于使用的計算pipieline。 盡管 Locasale Lab 最近報告了他們基于 ssGSEA 的工作流程，但執(zhí)行此類分析仍然需要強大的計算背景并且非常耗時。 在這里，分析展示了一個 R 包 scMetabolism，它集成了 dropout 基因插補、代謝量化和數(shù)據(jù)可視化。 分析證明該工作流程與 Seurat scRNA-seq 工具包具有良好的兼容性，并且廣泛適用于 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集。 scMetabolism 的 R 包現(xiàn)在可以在 Github (https://github.com/wu-yc/scMetabolism) 上獲得。

scMetabolism 包由三個連續(xù)步驟組成

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• 注：The schematic plot of scMetabolism, a pipeline for quantifying single-cell metabolism based on scRNA-seq.
• 首先，scMetabolism 支持基于 ALRA 的 dropout 值的估算。
• 其次，scMetabolism 基于 VISION、AUCell 和 ssGSEA 量化代謝途徑活動。整合了報告的基因集并手動審查了來自 KEGG 和 REACTOME 的基因集，以生成高質(zhì)量代謝基因集的列表。
• 第三，scMetabolism 提供了三種不同的方式，包括箱線圖、UMAP/tSNE 圖和點圖，以可視化單個細胞的代謝多樣性。還在 PBMC、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌和睪丸等 4 個不同數(shù)據(jù)集上測試了 scMetabolism 的準確性（與已發(fā)表方法的比較）、一致性（不同方法之間的相關(guān)性，如 VISION 和 AUCell）和穩(wěn)定性（dropout模擬）來測試這條管道的性能。
• 最后，我們開發(fā)了一個易于使用的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器 scMetabolism online (http://www.cancerdiversity.asia/scMetabolism/)，供生物學(xué)家輕松量化單細胞的代謝活動。

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A Sharp Increase of Metabolic Activity of MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages in Liver Metastasis

為了了解 CRLM 中髓樣細胞的代謝情況，首先計算了抑制性巨噬細胞和單核細胞中所有 76 種活躍代謝途徑的得分。 其中，選擇了前 50% 的可變代謝評分，并根據(jù)其平均代謝評分對骨髓細胞（不包括低豐度的骨髓細胞）進行排名。 Strikingly，LM 浸潤的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞在所有骨髓細胞中表現(xiàn)出最高的代謝活動，表明它們非常有活力，這可能與其在轉(zhuǎn)移部位的獨特功能有關(guān)。

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• 注：The metabolic activity analysis of myeloid cells shows that MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages and SPP1⁺ macrophages in metastatic tumors have the highest metabolic score. The circle size and color darkness both represent the scaled metabolic score.

MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞的所有代謝相關(guān)基因的進一步無監(jiān)督聚類觀察到與周圍組織相關(guān)的強烈代謝偏好，確定了 42 條代謝途徑可能在 CRC 和 LM 浸潤的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞中上調(diào)。其中，苯丙氨酸代謝有助于產(chǎn)生酪氨酸，在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞中表達更高。隨后仔細研究了差異表達的代謝基因，發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性浸潤的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞中特異性上調(diào)的代謝基因，部分是已知藥物的靶基因。 GSTO1 是細胞色素 P450 代謝異物的一種酶，在 CRC 和 LM 浸潤的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞中顯著升高，并與分化相關(guān)。 IL4I1 和 MIF 是巨噬細胞激活所必需的基因，也顯示出相似的特征。通過使用 mIHC 驗證了這些代謝酶并觀察到基本一致的結(jié)果。

接下來query巨噬細胞的這種高代謝激活狀態(tài)是否在物種之間是保守的。因此，構(gòu)建了 CRLM 的小鼠模型，并將 scRNA-seq 應(yīng)用于原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性腫瘤。結(jié)果，在小鼠 CRLM 模型中發(fā)現(xiàn)了類似的巨噬細胞亞群，例如 Mrc1⁺ 巨噬細胞和 Spp1⁺ 巨噬細胞。然而，沒有觀察到這些巨噬細胞在原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位之間的顯著差異比例，可能是由于原發(fā)腫瘤是在皮下而不是在結(jié)腸中形成的。進一步的代謝量化顯示了富含 LM 和 CRC 浸潤巨噬細胞的特征代謝狀態(tài)。分析檢查了前 3 條差異表達途徑（小鼠模型中的 LM 與 CRC），其中一些在人和小鼠中是保守的。例如，氧化磷酸化和苯丙氨酸代謝在人和小鼠巨噬細胞之間是一致的。苯丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶Mif的表達也與人CRLM一致?？傊?，LM 中的巨噬細胞具有代謝活動的急劇增加，例如苯丙氨酸代謝。抑制這種代謝活動可能會調(diào)動抗腫瘤免疫反應(yīng)來控制晚期 CRC 的肝轉(zhuǎn)移。

為了說明代謝重編程與巨噬細胞表型變化的關(guān)聯(lián)，計算了巨噬細胞的經(jīng)典表型評分，例如抗原加工和呈遞、炎癥、血管生成、免疫抑制、吞噬作用、白細胞介素信號通路和補體。事實上，在 LM 中，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞的抗原加工和呈遞以及補體活性評分顯著增加，SPP1⁺ 巨噬細胞也顯示出類似的趨勢。某些基因如 HLA-A（MHC I 類分子之一）在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞中上調(diào)。進一步分析了 42 種腫瘤高代謝途徑與 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞表型評分之間的相關(guān)性。有趣的是，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化在內(nèi)的幾種巨噬細胞特異性代謝途徑與 LM 中的抗原加工和呈遞有很強的相關(guān)性，但在 CRC 中卻很弱。這些數(shù)據(jù)共同表明代謝在確定 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞表型中的潛在重要作用。

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NAC Responsive and Non-Responsive Tumors Harbor Distinct Immune Dynamics Especially Macrophages

為了探索 NAC 對抗腫瘤免疫的影響，我們使用 TooManyCells（參考文獻在TooManyCells identifies and visualizes relationships of single-cell clades） 對所有 CD45⁺ 細胞進行了聚類分析。有趣的是，觀察到 CRC 和 LM 之間細胞聚類的強烈差異。為了了解哪些細胞類型發(fā)生了變化，計算了bootstrapped cell proportion并進行了差異分析。值得注意的是，NAC 對 TME 的影響是高度特定于細胞類型和context的。通常，在 PR 腫瘤中，NAC 可以下調(diào)免疫抑制細胞并激活腫瘤中的細胞毒性細胞。在 LM 中，反應(yīng)性 NAC 下調(diào) SPP1⁺ 巨噬細胞，但上調(diào)細胞毒性 T 細胞，如 GZMK⁺ CD8⁺ T 細胞和 XCL1⁺CD8⁺ T 細胞。特別是，在 NAC-PR 腫瘤中只剩下幾個 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和幾十個 SPP1⁺ 巨噬細胞，表明 NAC 在抑制巨噬細胞譜系中的潛在作用。然而，在 PD/SD 腫瘤中，觀察到與 PR 腫瘤不同的免疫細胞變化。例如，在LM中浸潤的SPP1⁺巨噬細胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬細胞水平增加，而細胞毒性免疫細胞（即FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T細胞）被下調(diào)。 這些相反的結(jié)果可能是由器官特異性和治療功效相關(guān)的癌細胞的重塑。例如，轉(zhuǎn)移性 PD/SD 癌細胞表現(xiàn)出 DNA 修復(fù)和脂肪酸代謝的特異性富集，而轉(zhuǎn)移性 PR 癌細胞與脂肪生成更相關(guān)?；蛘?，NAC 治療也可以直接和差異地調(diào)節(jié)個體免疫亞群。除腫瘤外，NAC上調(diào)鄰近正常肝臟中GZMB⁺CD8⁺T細胞的比例，并增加PR患者PBMC中FGFBP2⁺GZMB⁺CD8⁺T細胞的比例。對于 PD/SD 患者，在鄰近結(jié)腸和肝臟中也觀察到 FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T 細胞水平降低?？傊Y(jié)果表明，有效的 NAC 不僅重新編程了腫瘤內(nèi)免疫平衡，還激活了全身抗腫瘤免疫反應(yīng)，為支持 NAC 在可切除 CRLM 中的潛在用途提供了證據(jù)。

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• 注：Neoadjuvant Chemotherapy Restored the Immune Balance by Activating Cytotoxic Immune Cells and Inhibiting Immunosuppressive Cells in Metastatic Tumors. (A) The cell clustering in chemotherapy PD/SD, and PR tumors are largely different. (B) The dot plot shows the cell composition difference between untreated and NAC-PR tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (C) The dot plot shows cell composition difference between untreated and NAC-PD/SD tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (D) The cellular changes between untreated and NAC-PR tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion.(E) The cellular changes between untreated and NAC-PD/SD tumors. P values were determined by 1018 Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (F)The proportional changes of selected cell types between untreated, PR, and PD/SD samples. ***, adjusted P < 0.005. Adjusted P values were determined by Wilcox test.

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Metabolic Reprogramming of Macrophages Induced by Neoadjuvant Chemotherapy in Responsive Tumors

考慮到 NAC 主要影響髓細胞群，尤其是巨噬細胞，因此query巨噬細胞的軌跡是否由 NAC 編輯。根據(jù)接受 NAC 治療反應(yīng)來劃分骨髓細胞的 UMAP 分布，并確定了 PD/SD 和 PR 樣本之間豐富的骨髓表型多樣性。在未處理的樣本中，可以觀察到骨髓細胞的發(fā)育軌跡，而 PR 組的骨髓細胞富含單核細胞表型，巨噬細胞的祖細胞狀態(tài)，表明早期分化狀態(tài)。 bootstrap 細胞比例差異分析證實了 NAC-PR 腫瘤中巨噬細胞缺乏終末狀態(tài)，例如 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和 SPP1⁺ 巨噬細胞的顯著下調(diào)。相比之下，與未經(jīng)治療的腫瘤相比，NAC-PD/SD 腫瘤的 MRC1⁺CCL18⁺巨噬細胞和 SPP1⁺ 巨噬細胞水平顯著增加。接下來利用 mIHC 來檢查另一個獨立隊列中的巨噬細胞（n = 18，未處理；n = 9，NAC-PR），證實 NAC-PR LM 中 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和 SPP1⁺ 巨噬細胞的浸潤較低。使用 dynverse 的軌跡推斷分析進一步確定了從 S100A9⁺ 單核細胞到 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞的清晰發(fā)展軌跡，表明未處理與 NAC-PR 細胞的相反極化。通過關(guān)注分別代表 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和單核細胞的 MRC1 和 S100A9 表達，再次證明化療反應(yīng)細胞表現(xiàn)出富含單核細胞的表型。相反，在PD/SD組中，未觀察到巨噬細胞的軌跡重編程。結(jié)果表明，化療對巨噬細胞的軌跡阻斷是反應(yīng)性腫瘤獨有的。

鑒于轉(zhuǎn)移性腫瘤中 MRC1⁺ CCL18⁺ 和 SPP1⁺ 巨噬細胞數(shù)量有限，對未處理和 NAC 處理的樣本之間的所有髓細胞進行了通路富集分析，發(fā)現(xiàn) NAC 誘導(dǎo) PR 和 PD/SD 組 LM 中髓細胞的特定功能變化PR組中的巨噬細胞顯示出核糖體基因特征的富集，而PD/SD組中的巨噬細胞與補體和凝血級聯(lián)相關(guān)。然后，專注于代謝變化的 scMetabolism 管道顯示 NAC 顯著阻止了骨髓代謝，PR 組顯示出更多的下調(diào)代謝。在 CRC 和 LM 的 PD/SD 和 PR 組的巨噬細胞中，糖酵解和糖異生持續(xù)下調(diào)。相比之下，PD/SD 組的巨噬細胞也與特定的代謝途徑有關(guān)，例如 CRC 和 LM 中的磷酸肌醇代謝上調(diào)。總之，NAC 對髓系譜系進行了特定的代謝重編程，這可能會擴展我們對 NAC 誘導(dǎo)的抗腫瘤機制的理解，并為可切除的 CRLM 患者提供潛在的治療方法。

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Immune Microenvironment of Multifocal Metastasis Is Highly Diverse

正如最近報道的multifocal原發(fā)性肝癌的異質(zhì)性 TME 所證明的那樣，器官內(nèi)的很大一部分腫瘤是multifocal，具有多種遺傳、分子和免疫學(xué)特征。multifocal LM 是否具有多樣化的免疫微環(huán)境和對化療的獨特反應(yīng)仍不清楚。為了普遍捕獲轉(zhuǎn)移間免疫異質(zhì)性，對 4 名multifocal LM（P5、P7、P9 和 P10）患者的所有 CD45⁺ 細胞進行了無監(jiān)督聚類。有趣的是，multifocal轉(zhuǎn)移顯示出不同的免疫特征。對于未治療的患者 (P10)，LM 位點 2 位于相鄰肝臟的同一cluster中，而 LM 位點 1 與任何其他樣本都不相似。另外 3 個 NAC 治療的multifocal LM 也具有轉(zhuǎn)移間異質(zhì)免疫特征。接下來，bootstrap 細胞比例分析表明，在未處理的樣本中，免疫抑制細胞在不同 LM 位點之間顯著且差異化地浸潤，其中 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞在 P10 的 LM 中差異化浸潤。它們還具有不同的轉(zhuǎn)移間表型/代謝活性，例如抗原加工和呈遞。因此，這種相當(dāng)大的轉(zhuǎn)移間異質(zhì)性可能導(dǎo)致對化療和其他治療的不同反應(yīng)，這在臨床實踐中得到了充分證明。

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DISCUSSION

在這里，使用最先進的高通量 scRNA-seq 和 ST 定義了 CRLM 的細胞和空間免疫landscope。 眾所周知，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性 CRC 細胞之間的基因組差異相對較低。 然而，分析的數(shù)據(jù)顯示免疫微環(huán)境在 LM 中經(jīng)歷了廣泛的時空重塑，具有強烈的免疫抑制細胞富集，與之前基于大樣本的研究一致。 特別是，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞顯示出終末分化狀態(tài)，表現(xiàn)出代謝高能表型，并且對新輔助化療敏感。 我們的研究不僅揭示了以前未被認識的 CRLM 免疫生態(tài)系統(tǒng)的多樣性，而且還為癌癥研究界提供了全面的資源。
通過應(yīng)用 scMetabolism（一種用于量化 CRLM 數(shù)據(jù)上單細胞代謝活動的新型 R 包），驚訝地發(fā)現(xiàn)抑制性 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞表現(xiàn)出最高的代謝活性，尤其是在轉(zhuǎn)移性腫瘤中，這表明腫瘤內(nèi)免疫抑制細胞具有高能量 . 然而，化療后，這些免疫抑制細胞的代謝顯著減慢。 例如，對巨噬細胞發(fā)育和命運決定至關(guān)重要的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝被 NAC 下調(diào)。scMetabolism pipeline不僅揭示了 CRLM 免疫微環(huán)境的代謝landscope，而且為發(fā)現(xiàn)其他 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集的功能性代謝檢查點和途徑開辟了新的計算機會。

與晚期卵巢癌中 NAC 相關(guān)的免疫激活（NK 細胞浸潤增加和 T 細胞寡克隆擴增）相比，驚訝地觀察到巨噬細胞的細胞狀態(tài)在 NAC 反應(yīng)性患者中重新編程。在 PR 樣本中，僅存在一小部分終末抑制性巨噬細胞，如 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬細胞和 SPP1⁺ 巨噬細胞，而在 PD/SD 樣本中觀察到相反的趨勢。從機制上講，一種可能性是這種免疫重編程是由癌細胞的化學(xué)治療調(diào)節(jié)誘導(dǎo)的，另一組也報道了利用離體培養(yǎng)平臺的化學(xué)調(diào)節(jié)作用。隨著免疫抑制細胞的減少，細胞毒性細胞顯著增加，如 XCL1⁺CD8⁺T 細胞。因此，數(shù)據(jù)顯示 NAC 有力地恢復(fù)了化療反應(yīng)患者的腫瘤內(nèi)免疫平衡，解碼了有利于這些患者新輔助化療的其他機制。

轉(zhuǎn)移性多灶性腫瘤具有不同的免疫微環(huán)境組成。 即使在同一患者的同一組織內(nèi)，抑制性免疫細胞也具有不同的豐度和不同的功能狀態(tài)。 至于多灶性肝細胞癌，我們最近報道了不同的病變誘導(dǎo)了異質(zhì)性 TCR 擴增，這可能會施加免疫選擇。 另一個獨立的研究小組還發(fā)現(xiàn)，在一名患有多灶性病變的高級別漿液性卵巢癌患者中，進行性轉(zhuǎn)移排除了免疫細胞，而退化性病變則被 CD8 T 細胞浸潤。 這可以部分解釋臨床實踐中同一患者的多灶性腫瘤的不同藥物反應(yīng)。 我們的數(shù)據(jù)將允許針對多灶性 CRLM 的最佳合理組合療法的新設(shè)計，例如組合 NAC、代謝檢查點抑制劑和免疫療法。

本文的研究確實有一些局限性。 由于符合納入標準（化療方案和樣本可切除性）的患者數(shù)量有限，我們的 ST 隊列中僅招募了 4 名患者。 其次，ST 技術(shù)還沒有達到單細胞分辨率。 當(dāng)前的 10X Visium 平臺僅支持在每個點估計 1-10 個細胞。 更精確的空間圖，例如 Slide-seq 和 DBiT-seq，對于更好地理解如何在治療上靶向這種復(fù)雜疾病的時空異質(zhì)性至關(guān)重要。 第三，化療如何誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性腫瘤巨噬細胞的功能改變?nèi)圆磺宄?需要進一步的實驗驗證來驗證巨噬細胞的這種狀態(tài)轉(zhuǎn)變是由于分化的改變或種群變化（即巨噬細胞耗竭或單核細胞募集）。

In summary, we present the spatial & cellular atlas of CRLM and pinpoint the functional impacts of neoadjuvant chemotherapy on TME. Our scMetabolism pipeline not only deepens our understanding into the immunobiology of CRLM, but also enables the unbiased discovery of active metabolic states in other complex tissues. These findings provide unique insights into the biology of cancer spreading and raise the possibility to target metabolism pathways in metastasis.

Method（關(guān)注一點重點方法）

Cellular proportion analysis

To perform the differential cell-type composition analysis, we utilized scDC algorithm to conduct the bias-corrected and accelerated bootstrap analysis for cell-type proportion comparison. We used the scDC_noClustering function to perform the bootstrap resampling cell-type composition analysis (calCI = TRUE, calCI_method = BCa, nboot = 1000). To find out the tissue specific cellular types, we used the median value of bootstrap resampled cellular composition, filtered the immune cells with low composition, and performed the unsupervised clustering analysis.

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