今年1月份發(fā)表在Cell Death Dis (IF: 9.685)上的文章

1. Danger signal extracellular calcium and CPPs induce differentiation of monocytes into macrophage-like cells

作者此前的研究顯示在LPS存在的情況下，胞外鈣濃度的增加可以作為danger signal激活NLRP3炎癥小體和細(xì)胞焦亡。Here we show that the danger signal extracellular calcium induces macrophage differentiation and survival when LPS is absent.
Fig 1a-c：在胞外鈣濃度增加的情況下，單核細(xì)胞分化成macrophage樣細(xì)胞 (calcium-macrophages)。當(dāng)不存在其他survival factors，只有FCS- supplemented culture media時(shí)，培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)在2天左右死亡。與“煎蛋狀”的GM-CSF-macrophages和M-CSF-macrophages相比，calcium-macrophages呈“needle-like shape”。
Fig 1d：和M-CSF-macrophages的多核相比，calcium-macrophages與GM-CSF-macrophages一樣，主要是單個(gè)核。
Fig 1e：沒(méi)有calcium or growth factors的單核細(xì)胞在兩天內(nèi)死亡。在鈣誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化的第二天，活細(xì)胞比例為57.0% ± 5.3（GM-CSF-macrophage cultures: 97.0% ± 0.8； M- CSF-macrophage cultures: 96.0% ± 0.3）。在第七天時(shí)，所有的培養(yǎng)方式都有大于97%的巨噬細(xì)胞存活率。

Fig 1f：為了探究CaSR在calcium- macrophages分化中的作用，作者使用了CRISPR-Cas9構(gòu)建的CaSR-deficient monocytic THP-1細(xì)胞系。結(jié)果顯示CaSR-deficient monocytic THP-1細(xì)胞對(duì)胞外鈣信號(hào)增加的敏感性下降，細(xì)胞分化減少。

在此前的研究中，作者發(fā)現(xiàn)RA患者的單核細(xì)胞表達(dá)CaSR增加。
Fig 1g：Accordingly, 和正常相比，RA患者的單核細(xì)胞分化成的calcium-macrophages， elongation factor更高。

此前的研究顯示，胞外鈣離子的增加引起CPPs (composed of calcium, phosphate, and fetuin-A) 的合成增加，CPPs可以通過(guò)calcium-induced macropinocytosis被單核細(xì)胞攝取。為了探究CPPs對(duì)calcium-macrophages分化的影響，CPPs也被用于誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化。
Fig 1h：CPPs induce the differentiation of calcium- macrophages when the uptake of CPPs by macropinocytosis was facilitated by the presence of calcium.

2. Calcium-macrophages are different from GM-CSF- macrophages and M-CSF-macrophages

為了探究calcium-macrophages 和 GM-CSF 以及M-CSF-macrophages相比的異質(zhì)性，作者對(duì)這三種細(xì)胞進(jìn)行了CITE-seq測(cè)序。
Fig 2a-b：一共得到了16470個(gè)巨噬細(xì)胞(4362 calcium-macrophages, 6588 GM-CSF-macro- phages, 5520 M-CSF-macrophages)，分為11個(gè)細(xì)胞群。結(jié)合蛋白標(biāo)簽，可知clusters 2, 5, 和 11 是calcium macrophages；clusters 1, 4, 和 9 是 GM-CSF- macrophages；clusters 3, 6 和7 是 M-CSF- macrophages. Clusters 8 和 10 并沒(méi)有 mapped 到上述三類細(xì)胞。而且UMAP降維結(jié)果顯示，calcium- macrophages和另外兩種細(xì)胞存在較大轉(zhuǎn)錄差異。
Fig 2c-f：展示了每群的marker基因。calcium macrophages高表達(dá)SPP1。而且f圖的結(jié)果顯示，calcium macrophages和其他兩類巨噬細(xì)胞存在完全不同的表達(dá)模式。

calcium macrophages的TREM2也是高的啊，感覺(jué)比SPP1更特異。

為了進(jìn)一步探究calcium macrophages分化過(guò)程中的基因表達(dá)模式，作者進(jìn)行了DNA microarray analysis (n = 4)。
Fig 2g-h：結(jié)果顯示：最顯著的基因表達(dá)變化發(fā)生在分化起始的前兩天。pca的結(jié)果也顯示在day-1和其他的差異最大，day-2 到 day-7的轉(zhuǎn)錄模式則更為類似。

Fig 2

因?yàn)樽髡邷y(cè)的是CITE-seq，前面分析了單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄差異之后，作者又分析了蛋白差異。
Fig 3a：同樣的，calcium macrophages和其他兩組存在明顯蛋白表達(dá)差異。
Fig 3b-e：分別是GM的上調(diào)基因、M的上調(diào)基因、Ca和GM相比的上調(diào)基因及Ca和M相比的上調(diào)基因。
Fig 3f-h：calcium macrophages顯著上調(diào)的蛋白包括FABP4, FABP5和SPP1。
Fig 3i：Resting calcium-macrophages 可以分泌高濃度 SPP1/ Osteopontin, 而RA patients的 calcium-macrophages 產(chǎn)生了更高濃度的 SPP1/Osteopontin。

SPP1/Osteopontin can be modified by thrombin cleavage which exposes an epitope for integrin receptors
Fig 3j：F2/ prothrombin也是上調(diào)的top30蛋白之一(e)，在calcium-macrophages中顯著上調(diào)。
Fig 3k：一致的，cleaved SPP1/Osteopontin在calcium-macrophages的培養(yǎng)上清中被檢測(cè)到，而且在RA calcium-macrophages的上清中濃度更高。
Fig 3l：此外，CD44 (SPP1/Osteopontin的受體)也顯著上調(diào)(e)，在calcium-macrophages中顯著上調(diào)。

Fig 3

3. Calcium-macrophages have a pro-inflammatory and migratory phenotype

為了探究calcium-macrophages 在激活后更像GM- CSF-macrophages 還是 M-CSF-macrophages，作者使用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化。
Fig 4a-d：LPS促進(jìn)了多種促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

隨后作者對(duì)LPS-stimulated macrophages進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示LPS-activated calcium-macrophages和另外兩種巨噬激活后存在顯著差異，更高的表達(dá)各種促炎因子和趨化因子比如IL1A和IL1B。

We have previously shown that LPS together with the danger signal extracellular calcium activates the NLRP3 inflammasome, which leads to the secretion of IL-1β and IL-18.
Fig 5a-e：和control相比，激活的calcium-macrophages產(chǎn)生更高的促炎因子IL-1β, IL-1α, 和 IL-18。而抑炎的IL-1RA 和 IL-18bp 則產(chǎn)生較低。RA calcium-macrophages responded with an even higher pro- inflammatory and a lower anti-inflammatory cytokine production compared to healthy donors
Fig 5f-g：Both anti-inflammatory cytokines were also secreted by resting calcium-macrophages.
Fig 5h-i：和control相比，calcium-macrophages 還產(chǎn)生更高水平的PGE2和COX2。
Fig 5j-m：劃痕實(shí)驗(yàn)顯示RA calcium-macrophages的遷移潛能更高。

4. Calciprotein particles are not degraded in the lysosomes

單核細(xì)胞攝取 CPPs 是通過(guò) calcium-induced, CaSR-依賴性 macropinocytosis (巨胞飲)。而CaSR-deficient THP-1由于不能感受鈣離子因而不能發(fā)生macropinocytose CPPs。
Fig 6a：PMA是macropinocytosis的誘導(dǎo)劑，PMA誘導(dǎo)下，CaSR-deficient THP-1通過(guò)macropinocytosis 對(duì) CPPs 進(jìn)行吞噬時(shí)，elongated calcium-macrophages被檢測(cè)到 (和沒(méi)有PMA相比)。
Fig 6b-d：Macropinosomes fuse with lysosomes to initiate degradation of macropinosome content. 作者使用 lysotracker 對(duì)lysosomes進(jìn)行染色，calcein-labeled CPPs和lysosomes的共定位僅在一小部分CPP陽(yáng)性的單核細(xì)胞中檢測(cè)到。

為了分析單核細(xì)胞溶酶體中蛋白的降解，作者使用了DQ-BSA。

DQ-BSA染料：一種被熒光染料標(biāo)記的自淬的蛋白質(zhì)，一旦進(jìn)入溶酶體，DQ-BSA就會(huì)被溶酶體蛋白酶裂解，導(dǎo)致熒光片段的不淬滅和釋放，發(fā)出明亮的熒光。因此，DQ-BSA可用來(lái)指示溶酶體的功能是否正常。

Fig 6e-g：結(jié)果顯示僅有一小部分的CPP⁺單核出現(xiàn)了DQ-BSA的陽(yáng)性，而CPP^-單核則有很多出現(xiàn)了DQ-BSA的陽(yáng)性。calcein-labeled CPPs 和 DQ-BSA共定位分析顯示most of the DQ-BSA was found not to be co-localized with CPPs。

最近有研究顯示CPPs可以增加 the fused endosomes/lysosomes 的PH，因此 pH-sensitive dyes 比如 lysotracker 不適合于這種情況下的lysosomes檢測(cè)。
Fig 6h-j： indeed, lysotracker fluorescence was reduced
Fig 6k-m： 而pH-依賴性 LAMP2 溶酶體染色在calcium-stimulated monocytes增加，提示鈣離子引起 fused endosomes/ lysosomes的PH增加和lysosome content增加。

為了分析calcium-macrophages的溶酶體PH，作者使用了LysoSensor dye.
Fig 6n-o： 和預(yù)期一致，calcium-macrophages的平均熒光強(qiáng)度下降。

當(dāng) CPP 存在時(shí)，DQ-BSA 不降解，并且calcium- stimulated monocytes的fused endosomes/lysosomes 中 pH 值升高表明 CPP 和所含的胎球蛋白 A 無(wú)法降解，這可以引起溶酶體應(yīng)激。 如果在巨胞飲作用后胎球蛋白-A 確實(shí)沒(méi)有被降解，它應(yīng)該仍然存在于分化的巨噬細(xì)胞中 7 天。
Fig 6p： 果然，calcium-macrophages的bovine fetuin-A比對(duì)照要高。

5. Disruption of lysosomal homeostasis induces TFEB and STAT3 transcription factors

眾所周知，溶酶體穩(wěn)態(tài)與雷帕霉素機(jī)制靶點(diǎn)（mTOR）途徑相關(guān)，當(dāng)溶酶體功能正常時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子EB（TFEB）以mTORC1依賴性方式磷酸化并保留在細(xì)胞質(zhì)中。 當(dāng)溶酶體功能受損時(shí)，mTORC1 失活，未磷酸化的 TFEB 易位進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)溶酶體蛋白的表達(dá)。
Fig 7a： 作者發(fā)現(xiàn)，和control相比，calcium-macrophages的mTORC1, S6 ribosomal protein (S6rp)和 ribosomal protein S6 kinase (p70S6K)的磷酸化/活化顯著下降。提示calcium- stimulated monocytes中mTORC1未活化。
Fig 7b, c： 一致的，calcium- stimulated monocytes中TFEB的核轉(zhuǎn)位增加。
Fig 7d-e： TFEB的靶基因分析顯示在分化成calcium-macrophages過(guò)程中，CLEAR (Coordinated Lysosomal Expression and Regulation) 基因網(wǎng)絡(luò)顯著上調(diào)，而且其上調(diào)在分化后7天也仍然存在。STAT3-signaling對(duì)于調(diào)節(jié)溶酶體平衡至關(guān)重要。底物超載促進(jìn)溶酶體蛋白的 STAT3 依賴性轉(zhuǎn)錄，包括組織蛋白酶 B/D，作者發(fā)現(xiàn)其在 TFEB 靶基因中上調(diào)。
Fig 7f, g：使用 ImageStream 分析 STAT3 的細(xì)胞內(nèi)定位表明存在鈣誘導(dǎo)的 STAT3 核轉(zhuǎn)位。

Fig 7h：為了測(cè)試 TFEB 或 STAT3 是否參與鈣誘導(dǎo)的溶酶體增加，使用了 mTOR 激活劑 MHY1485（以促進(jìn) mTORC1 依賴性 TFEB 磷酸化和胞質(zhì)溶膠保留）和 STAT3 抑制劑 S3I-201。 兩者都導(dǎo)致抑制鈣誘導(dǎo)的 LAMP2-熒光增加，提示轉(zhuǎn)錄因子TFEB和STAT3都參與溶酶體蛋白表達(dá)和生物合成。
Fig 7i：在 THP-1 鈣巨噬細(xì)胞分化模型中，mTOR 激活劑 MHY1485 對(duì) TFEB 核轉(zhuǎn)位的抑制導(dǎo)致部分抑制，而 S3I-201 對(duì) STAT3 的抑制完全減弱了鈣巨噬細(xì)胞分化。

Discussion

該研究表明，細(xì)胞外鈣濃度的增加會(huì)導(dǎo)致 CPP 的形成和攝取，以及隨后單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞。值得注意的是，這個(gè)過(guò)程不需要額外的生長(zhǎng)因子，如 GM-CSF 或 M-CSF。 鈣巨噬細(xì)胞具有獨(dú)特的形態(tài)表型，它們分化成needle like cells。 盡管 M1/M2 模型已經(jīng)過(guò)時(shí) ，但作者在 GM-CSF 巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到更多的促炎細(xì)胞因子和更少的抗炎 IL-10，而不是在 M-CSF 巨噬細(xì)胞中，兩者分別類似于“促炎 M1”巨噬細(xì)胞 和“愈合M2”巨噬細(xì)胞。scRNA-seq、DNA 微陣列、蛋白質(zhì)組學(xué)和功能分析結(jié)果顯示，和對(duì)照巨噬細(xì)胞相比，鈣巨噬細(xì)胞顯示出獨(dú)特的表型。 這種表型的特征包括needle like shape、過(guò)度的組成型 SPP1/骨橋蛋白產(chǎn)生、強(qiáng)烈的促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生、抗炎介質(zhì)分泌的缺乏以及明顯的遷移潛力。 從 RA 患者的單核細(xì)胞中分化出來(lái)的鈣巨噬細(xì)胞顯示出這種表型的整體更強(qiáng)的表現(xiàn)。