細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）是機(jī)體抗腫瘤和抗病毒感染的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，CTL通過T細(xì)胞受體（TCR）特異識別靶細(xì)胞表面MHC-I 與抗原多肽形成的復(fù)合物，進(jìn)而釋放穿孔素、顆粒酶等生物活性物質(zhì)對靶細(xì)胞進(jìn)行溶解。鑒于CTL在治療腫瘤和病毒性疾病中的潛在作用，對CTL的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究備受關(guān)注，大多研究集中于對TCR基因的改造。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，TCR基因克隆、轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)已較成熟，研究方向主要是如何保證TCR基因高效、正確表達(dá)組裝成為具生物活性的分子。

機(jī)體免疫防御主要由體液免疫與細(xì)胞免疫兩大系統(tǒng)構(gòu)成，其中以CD8+Ｔ淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用。CD8+Ｔ從靜息性T細(xì)胞活化為具有特異殺瘤作用的細(xì)胞毒性Ｔ淋巴 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL)經(jīng)過如下3個(gè)關(guān)鍵步驟：第一步是抗原加工與提呈，主要由專職抗原提呈細(xì)胞樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC)負(fù)責(zé); 第二步是識別與活化，CD8+ T細(xì)胞通過其表達(dá)的T細(xì)胞受體(T cell receptot, TCR)特異識別DC提呈的ＭＨC-Ⅰ-多肽復(fù)合物，接受T細(xì)胞活化的第一信號，DC表面豐富的免疫共刺激分子給予T細(xì)胞活化的第二信號;第三步是識別與殺傷，活化的CTL通過TCR特異識別瘤細(xì)胞表面MHC-1-多肽復(fù)合物，釋放穿孔素和顆粒酶等生物活性物質(zhì)溶解瘤細(xì)胞，或通過Fas-FasL途徑誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡。CTL的TCR對腫瘤抗原的識別是發(fā)揮其效應(yīng)的基礎(chǔ)，抗原識別的特異性取決于TCR結(jié)構(gòu)的多肽性。越來越多的研究小組利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)克隆能識別特定抗原表位的TCR基因，構(gòu)建TCR基因病毒載體再轉(zhuǎn)染外周CD8+ T細(xì)胞，將之修飾成為能識別特定靶抗原的CTL。體外大規(guī)模擴(kuò)增經(jīng)TCR基因修飾的CTL，將為腫瘤及傳染性疾病提供新型、特異的治療手段。

1. TCR結(jié)構(gòu)

TCR是T細(xì)胞表面能夠特異性識別抗原表位和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子，TCR的多態(tài)鏈依編碼基因不同命名為α、β、γ、δ鏈，分別形成αβTCR和γδTCR。 人外周血中約95%為γδTCR，約5%為αβTCR。

TCR分子是由兩條糖基肽鏈通過二硫鍵組成的異二聚體。所有α、β、γ、δTCR肽鏈均可分為胞外、 跨膜(TM)和胞質(zhì)(Cy)3部分。胞外部分又分為可變區(qū)（V）、高變區(qū)（D）、結(jié)合區(qū)（J）和恒定區(qū)（C）。α鏈 由V、J、C基因編碼，β鏈由V、D、J、C基因編碼。兩鏈不同區(qū)域等位基因的重排決定了TCR的多態(tài)性，賦予了T細(xì)胞識別不同抗原的巨大潛力。TCRα和β肽鏈可變區(qū)存在4個(gè)氨基酸高變區(qū)（hypervariable region, HVR），亦稱互補(bǔ)決定區(qū)（complementarity determining region, CDR），其中CDR1、CDR2，CDR3又稱為超變區(qū)，是抗原特異性結(jié)合部位。TCR多態(tài)性主要由CDR3決定。

2. TCR基因克隆

克隆TCR基因的關(guān)鍵是分離到具有高親和力的識別抗原肽的T細(xì)胞克隆。已經(jīng)有多個(gè)課題組利用不同技術(shù)從不同來源獲得CTL克隆。Morgan等從黑色素瘤患者的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中分離出能識 別MART-1抗原表位的T細(xì)胞克隆。Zhang等從慢性丙型肝炎患者外周血中分離得到HCV特異性的CTL克隆。Morgan等運(yùn)用HLA-A2限制性多肽體外致敏預(yù)先免疫該多肽患者的外周血淋巴細(xì)胞 （peripheral blood lymphocyte, PBL），然后用有限稀釋法獲得CTL克隆。Varela-Rohena等運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)分離抗原特異性TCR。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）、反轉(zhuǎn)錄PCR （reverse transcription PCR，RT-PCR）技術(shù)克隆上述TCRα、β鏈全長基因。利用基因掃描技術(shù)對TCR CDR3區(qū)域進(jìn)行分析，了解其可能存在的亞家族。 Meyerhuber等運(yùn)用此方法從HER2(369-377)特異性CTL中成功克隆了TCR基因。

3. TCR基因轉(zhuǎn)移載體

3.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

目前在TCR基因轉(zhuǎn)染過程中報(bào)道較多的是運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有多方面優(yōu)勢，感染細(xì)胞范圍廣，不僅適用于單層培養(yǎng)的細(xì)胞，而且適用于懸浮培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞;機(jī)體對載體產(chǎn)生的免疫反 應(yīng)較低，在宿主內(nèi)可以穩(wěn)定遺傳;往往以低拷貝整合，避免了基因重排;經(jīng)特殊構(gòu)建的反轉(zhuǎn)錄病毒載體是缺陷型的，比較安全;選擇不同的外殼蛋白進(jìn)行包裝，可賦予病毒特定的宿主選擇性，從而達(dá)到靶向?qū)氲哪康摹?/p>

Morgan等從黑色素瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）中獲得能識別 MART-1抗原表位的CTL克隆，從中克隆到TCR基因，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將該基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入至人外周血 T淋巴細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后治療17例Ⅳ期黑色素瘤患者，15例患者在治療2個(gè)月后循環(huán)T細(xì)胞數(shù)量至少增加了10％，2例患者病情得到控制，在18個(gè)月內(nèi)未復(fù)發(fā)。Parkhurst等將癌胚抗原（carcino-embry-onic antigen, CEA）特異性TCR構(gòu)建入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人外周血淋巴細(xì)胞，在TCRα鏈CDR3區(qū)域引入單核苷酸突變，增強(qiáng)了TCR的親和性。臨床試驗(yàn)對3例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進(jìn)行治療，結(jié)果所有病例血清CAE水平均有所下降（74％~99％）。

目前較常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為Moloney小鼠白血病病毒改構(gòu)的各類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，理論上它能轉(zhuǎn)染幾乎100％的靶細(xì)胞，但實(shí)際的轉(zhuǎn)染效率遠(yuǎn)低于此。近年來人們通過各種改良方法不斷提高逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體轉(zhuǎn)染效率。Yang等運(yùn)用高速離心法濃縮病毒，4℃，6000rpm，過夜，可使病毒滴度提高50~100倍，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)染效率。研究人員利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將TCRαβ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人初始T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在相同的病毒滴度下，以骨髓瘤病毒（myeloproliferative sarcoma virus,MPSV）或鼠干細(xì)胞病毒（murine stem cell virus, MSCV）為基礎(chǔ)載體比以小鼠白血病病毒（murine leukaemia virus, MLV）為基礎(chǔ)的載體有高轉(zhuǎn)染效率和高TCR表達(dá)。

改良的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已被多個(gè)研究組用于不同腫瘤相關(guān)抗原特異性TCR基因轉(zhuǎn)移中。但逆轉(zhuǎn)錄病毒只能感染分裂期細(xì)胞，容納外源基因的DNA片段長度不超過8000bp，病毒滴度低，有的反轉(zhuǎn)錄病毒可能具有激活癌基因的危險(xiǎn)。

3.2 慢病毒載體

慢病毒載體其優(yōu)點(diǎn)在于可有效轉(zhuǎn)染分裂和未分裂細(xì)胞;能穩(wěn)定整合到靶細(xì)胞的基因組中;可轉(zhuǎn)移約 8000~10000bp基因片段;能持久穩(wěn)定表達(dá)外源基因，不易導(dǎo)致基因沉默;沒有整合位點(diǎn)偏好性。

Yang等將識別MART-1和gp100的TCR基因重組入VSV-G假型第3代慢病毒載體，轉(zhuǎn)染外周T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)了特異性抗瘤活性，包括釋放γ干擾素和溶解瘤細(xì)胞。2010年該課題組運(yùn)用CD3抗體和PBL飼養(yǎng)細(xì)胞預(yù)刺激T細(xì)胞，明顯提高Ｔ細(xì) 胞轉(zhuǎn)染效率，12 d內(nèi)CD8+ T細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增達(dá)600倍，且具有特異性殺傷活性和記憶性。Stauss等對比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與慢病毒載體轉(zhuǎn)移WT-1特異性TCR研究表明，慢病毒載體相對比較安全，可獲得較高轉(zhuǎn)染效率。Canderan等設(shè)計(jì)了雜合非小細(xì)胞肺癌特異性TCR，該TCR是由人TCRV區(qū)和鼠TCRC區(qū)嵌合而成，后將該TCR構(gòu)建入慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T 細(xì)胞前體，產(chǎn)生特異性CD4＋ CD8＋可穩(wěn)定表達(dá)雜合TCR，T細(xì)胞體外增殖良好，并可特異性識別非小細(xì)胞肺癌。雖然慢病毒載體有較多優(yōu)勢，但存在有毒力恢復(fù)、垂直感染等潛在的安全隱患，仍需要臨床更多的深入研究。

3.3 非病毒載體系統(tǒng)

將外源基因直接用理化方法轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞。常用的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法有電穿孔技術(shù)、磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、顯微注射法等，其對外源基因片段大小無要求，安全性很高，但轉(zhuǎn)染效率很低。

TCR基因轉(zhuǎn)染的載體主要還是病毒載體，但研究人員一直都在嘗試尋找更理想載體系統(tǒng)。值得一 提的是，“睡美人”（sleeping beauty, SB）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已被應(yīng)用于TCR基因轉(zhuǎn)移過程中，Peng等報(bào)道， 該方法TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可與病毒載體相媲美，但該系統(tǒng)缺陷在于存在整合位點(diǎn)偏好性，這將是其應(yīng)用于臨床前亟待解決的問題。

4. TCR基因表達(dá)

研究人員將TCRα和β兩條鏈分別構(gòu)建入兩個(gè)獨(dú)立病毒載體中，因?yàn)榫幋aCR單鏈基因的小病毒載體容易包裝，可獲得較高的病毒滴度。但為了得到功能性的TCR，含有α和β兩條鏈的兩個(gè)病毒顆粒必 須同時(shí)轉(zhuǎn)染同一個(gè)T細(xì)胞。這種雙感染容易增加插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，此外，引入TCR單鏈易形成內(nèi)源與外源TCR鏈的雜合體。Dossett等用不同的啟動子來調(diào)控TCR兩條鏈的表達(dá)，其中TCRα鏈?zhǔn)芸赜谝?個(gè)長末端重復(fù)序列（long terminal repeat, LTR）元件，該元件也驅(qū)動報(bào)告基因neo的表達(dá)，TCRβ鏈的表達(dá)由雜合HTLV-I/SV40啟動子SRα來驅(qū)動。該方法易受啟動子的干擾，導(dǎo)致TCR表達(dá)下調(diào)。Wang等將HC/2G-1 TCR兩條鏈由一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site, IRES）原件連接，在一般啟動子啟動下作為一個(gè)單一轉(zhuǎn)錄盒來表達(dá)。IRES原件可以保證TCR兩條鏈同時(shí)表達(dá)，但I(xiàn)RES5′端基因通常較3′端基因表達(dá)量高，會導(dǎo)致突變的發(fā)生。 Chinnasamy等將TCR基因兩條鏈通過一個(gè)源自 微小RNA病毒的肽原件2A（2A peptide, p2A）來進(jìn)行連接。這種連接方式可以產(chǎn)生一條單一的編碼TCRα和β鏈的ｍRNA。翻譯時(shí)，核糖體可跳過2A肽序列，從而產(chǎn)生兩條單獨(dú)的肽鏈：TCRα-2A融合蛋白和甘氨酸TCRβ，這種連接方式可以等量表達(dá)TCRα和β鏈，此外肽序列要比IRES原件短，構(gòu)建的病毒載體較小，容易包裝，可獲得較高病毒滴度。

5. 影響TCR基因正確表達(dá)與表達(dá)效率的因素

TCR組裝和表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的過程，在細(xì)胞表面進(jìn)行表達(dá)之前，TCRα鏈和β鏈?zhǔn)紫刃纬僧愒炊垠w，然后與CD3復(fù)合物在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，最終TCR CD3復(fù)合物由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，在這個(gè)過程中會有諸多因素影響TCR的表達(dá)效率。

5.1 TCRα和β鏈密碼子優(yōu)化

密碼子優(yōu)化是指用人類基因組中常見的同義密碼子置換非常見密碼子。已有證據(jù)表明，密碼子優(yōu)化的TCR基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞中表達(dá)水平比野生型TCR基因有所提高，從而增強(qiáng)其體內(nèi)功能。但是，密碼子優(yōu)化可能產(chǎn)生免疫源性TCR，此過程也可能會伴隨多肽序列的改變產(chǎn)生另一種開放讀碼框，有一定風(fēng)險(xiǎn)。

5.2 TCRα和β鏈載體配置

TCR基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建時(shí)最好使用單病毒載體，可以同時(shí)編碼TCRα鏈和β鏈，這樣可以防止插入突變和轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞僅表達(dá)引入的1條鏈，可以減少引入鏈與相應(yīng)內(nèi)源性TCR鏈誤配的風(fēng)險(xiǎn)。如果存在TCR其中1條鏈供應(yīng)不足的情況，會削弱TCR異源二聚體的聚合細(xì)胞表面表達(dá)。近年來，研究人員運(yùn)用IRES序列或者P2A，連接TCRα鏈和β鏈構(gòu)建載體，很大程度上克服了載體配置造成的兩條鏈表達(dá)不均衡的問題。

5.3 外源性與內(nèi)源性TCR對CD3的競爭

有效的細(xì)胞表面TCR表達(dá)需要穩(wěn)定的TCR CD3復(fù)合體構(gòu)建。沒有CD3的情況下，TCR不能聚合而被降解。因此向T細(xì)胞內(nèi)引入外源性TCR時(shí)，CD3分子的存在是主要限速步驟。競爭可降低引入性TCR細(xì)胞表面表達(dá)。 引入性TCR的表達(dá)水平通常比內(nèi)源性TCR低，內(nèi)源性TCR可以削弱轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞對低濃度TCR識別抗原的反應(yīng)活性，這一結(jié)果驗(yàn)證了引進(jìn)TCR與內(nèi)源性TCR競爭有限的CD3分子。 Sachiko等通過小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的表達(dá)使內(nèi)源性TCR沉默以提高外源性TCR基因的表達(dá)和活性。最近研究表明，帶有編碼TCR α和β鏈基因載體與另一個(gè)編碼CD3γ、δ、ε、ζ基因的載體進(jìn)行雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)CD8+T細(xì)胞，可以提高CD8+T細(xì)胞活性。

5.4 外源性與內(nèi)源性TCRα和β鏈的誤配

有研究表明單獨(dú)α或β鏈轉(zhuǎn)導(dǎo)Ｔ淋巴細(xì)胞可導(dǎo)致外源性TCR鏈和內(nèi)源性TCR鏈混合二聚體的形成。外源性TCRα或β鏈與內(nèi)源性TCRα或β鏈的誤配導(dǎo)致目標(biāo)TCR自身配對減少，從而影響TCR的親和性。此外，誤配二聚體的形成可能會導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)等安全問題。Thomas等將TCR恒定區(qū)鼠源化，或進(jìn)行半胱氨酸修飾產(chǎn)生分子間二硫鍵，發(fā)現(xiàn)均可提高外源性TCRα和β鏈的正確配對。 Voss等在TCRα和β鏈恒定區(qū)插入一對相互作用氨基酸，改變TCR恒定區(qū)二級結(jié)構(gòu)（從“knob-into-hole”構(gòu)象變?yōu)椤癶ole-into-knob”）來提高兩條鏈的正確配對。

6. 結(jié)語

盡管目前TCR基因修飾CTL的基礎(chǔ)與臨床研究均取得較好進(jìn)展，但仍存在一些問題，如功能性TCR的正確表達(dá)、TCR表達(dá)效率、TCR基因修飾CTL的親和力與體內(nèi)有效性和存活時(shí)間、臨床安全性等均需要深入研究。