間充質(zhì)干細胞屬于成體干細胞，在體外不同條件下誘導(dǎo)分化為骨、軟骨及其他結(jié)締組織，因其來源廣泛，分離無創(chuàng)傷，較低的免疫原性、生長周期短等特點，是組織工程種子細胞的重要來源。干細胞的誘導(dǎo)分化一方面是干細胞鑒定的主要方法，另一方面也是干細胞功能學(xué)研究的主要途徑。采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，人間充質(zhì)干細胞應(yīng)能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細胞。成脂分化經(jīng)油紅O染色法鑒定，成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定，成軟骨分化經(jīng)阿爾辛藍染色法鑒定。
迪醫(yī)明生物不僅可以提供不同來源間充質(zhì)干細胞、iPS細胞，配套培養(yǎng)含血清和無血清培養(yǎng)體系以及誘導(dǎo)成脂、成骨、成軟骨完全培養(yǎng)基、三系分化染色鑒定試劑盒，特別推薦您選擇間充質(zhì)干細胞技術(shù)服務(wù)項目——成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)技術(shù)指導(dǎo)和誘導(dǎo)實驗外包服務(wù)。
迪醫(yī)明生物干細胞系列產(chǎn)品檢測結(jié)果表明，細胞無細菌、真菌、霉菌、支原體和病毒污染，表達多種間充質(zhì)干細胞特異性標記，具有良好的增殖和分化潛能，可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。
產(chǎn)品性能
1.細胞形態(tài)
2. 細胞表型
間充質(zhì)干細胞P20代細胞表型
流式細胞儀鑒定細胞表型
3.細胞誘導(dǎo)分化
3.1 成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化操作步驟
所需材料
0.05%Trypsin-0.02%EDTA（貨號：CD05-001C）
Phosphate-BufferedSaline (1×PBS) （貨號：BS01-001C）
間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基（貨號：CM01-001A）
間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號：DM01-001B）
間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號：DM02-001B）
間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號：DM03-001B）
成脂誘導(dǎo)分化步驟
注意：本操作規(guī)程以六孔板為例
1. 將間充質(zhì)干細胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 當細胞生長到達對數(shù)期時，用0.05%Trypsin-0.02%EDTA進行消化。
3. 將消化下來的間質(zhì)干細胞按照2×104 cells/cm2的細胞密度接種在六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。
4. 將細胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
5. 每隔三天換液，直到細胞融合度達到100%或者過融合。
6. 小心地將間質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基 A 液。
7. 誘導(dǎo)3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液。
8. 24h后，吸走B液，換回A液進行誘導(dǎo)。
9. A液和B液交替作用3-5次后（12-20天），繼續(xù)用 B 液維持培養(yǎng)4-7天直到脂滴變得足夠大、圓。B 液維持培養(yǎng)期間，每隔2-3天需要換用新鮮的B液。
成脂（油紅O染色） 成骨（茜素紅染色）
成骨誘導(dǎo)分化步驟
注意：本操作規(guī)程以六孔板為例
1. 將間充質(zhì)干細胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2. 當細胞融合度達到80-90%時，用0.05%Trypsin進行消化。
3. 將消化下來的間充質(zhì)干細胞按照2×104 cells/cm2 的細胞密度接種在事先包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。。
4. 將細胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
5. 當細胞融合度達到60%-70%時，小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。
6. 每隔3天換用新鮮的間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（使用前需預(yù)熱至37℃）
7. 誘導(dǎo)2-4周后，視細胞的形態(tài)變化及生長情況，用茜素紅進行染色。
注意：為防止成骨細胞脫落，建議成骨過程中出現(xiàn)大量鈣結(jié)節(jié)之后，換液形式變?yōu)槊績商煲淮伟肓繐Q液。
成軟骨誘導(dǎo)分化步驟
1. 進行成軟骨誘導(dǎo)實驗之前，需要對常規(guī)消化后的細胞進行計數(shù)。
2. 將3-4×105個細胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，250 g離心4 min。
3. 吸去上清，加入0.5 mL預(yù)混液，重懸上一步離心所得沉淀，以清洗間充質(zhì)干細胞，室溫下150 g離心5 min。
4. 重復(fù)步驟3，再次清洗細胞。
5. 將上一步所得沉淀用0.5 mL間充質(zhì)干細胞成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重懸。
6. 室溫下150 g離心5 min。
7.擰松離心管蓋以便于氣體交換，將其放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意：
① 此步驟不要吸掉上清和重懸細胞。
② 24 小時之內(nèi)不要搖動離心管。
8. 當細胞團出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象時（一般為24 h或48 h后，實際視細胞生長情況而定）輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。
9. 自接種開始計算，每隔2-3 d 給細胞換用新鮮的成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，每管約0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。
注意：小心操作，不要吸出軟骨球。
10.換液之后，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。稍加擰松離心管蓋放入37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。
11.一般持續(xù)誘導(dǎo)21-28天后，可對軟骨球進行福爾馬林固定和石蠟包埋切片，最后進行阿利辛藍染色。
成軟骨（阿利新藍染色）
