標(biāo)題: Tree Shrew Genome-Wide CRISPR?Screen Identifies RNF6 as a Proviral Host Factor for Zika Virus Replication in?Brain Microvascular Endothelial Cells （樹(shù)鼩全基因組CRISPR篩選鑒定出RNF6是寨卡病毒在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中復(fù)制的病毒前體宿主因子）
期刊: Viruses (MDPI), 2026年3月發(fā)表
文獻(xiàn)概要
本研究建立了首個(gè)樹(shù)鼩（Tupaia belangeri）全基因組CRISPR/Cas9敲除（GeCKO）篩選平臺(tái)，在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）中系統(tǒng)鑒定寨卡病毒（ZIKV）感染的宿主因子。
采用英格恩（Engreen）產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)部分
1. siRNA介導(dǎo)的基因敲低實(shí)驗(yàn)（第4頁(yè)，2.4節(jié)）
項(xiàng)目內(nèi)容
產(chǎn)品Engreen轉(zhuǎn)染試劑（北京英格恩生物科技有限公司）
貨號(hào)4000-3
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>驗(yàn)證候選基因（RNF6、DNAL1、AGK、RECK、CCN6）的敲低效果
實(shí)驗(yàn)方法將特異性siRNA或陰性對(duì)照siRNA（si-NC）轉(zhuǎn)染至BMECs，敲低內(nèi)源性候選基因
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)：
使用至少兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（Ensembl、NCBI、Tree? ? Shrew Database）的同源轉(zhuǎn)錄序列設(shè)計(jì)siRNA
所有siRNA由GenePharma（上海）設(shè)計(jì)合成通過(guò)轉(zhuǎn)染試劑將siRNA導(dǎo)入BMECs細(xì)胞
2. RNF6基因敲除實(shí)驗(yàn)（第4頁(yè)，2.6節(jié)）
項(xiàng)目內(nèi)容
產(chǎn)品Engreen轉(zhuǎn)染試劑
貨號(hào)4000-05
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/b>建立穩(wěn)定的RNF6基因敲除（RNF6-KO）細(xì)胞系
實(shí)驗(yàn)方法CRISPR/Cas9介導(dǎo)的RNF6基因敲除
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)：
使用來(lái)自sgRNA文庫(kù)的特異性sgRNA（5′-CAAAGCGAGGGGCAGCGATT-3′）將0.4 μg RNF6-KO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至樹(shù)鼩BMECs 通過(guò)有限稀釋法分離單克隆RNF6-KO細(xì)胞 Western blotting確認(rèn)敲除效率最高的克隆
實(shí)驗(yàn)意義
1. 技術(shù)驗(yàn)證意義
GeCKO篩選平臺(tái)的可靠性驗(yàn)證：通過(guò)siRNA敲低和CRISPR敲除的雙重驗(yàn)證，確認(rèn)了全基因組篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性
RNF6的前病毒作用確證： loss-of-function（敲低/敲除）和gain-of-function（過(guò)表達(dá)/回補(bǔ)）實(shí)驗(yàn)形成了完整的證據(jù)鏈
2. 科學(xué)發(fā)現(xiàn)意義
首次發(fā)現(xiàn)RNF6在病毒感染中的功能：此前RNF6主要研究集中于腫瘤學(xué)領(lǐng)域，本研究首次揭示其作為ZIKV前病毒因子
機(jī)制探索基礎(chǔ)：為后續(xù)RNF6-NS5相互作用、I型干擾素通路調(diào)控等機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)
3. 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義
宿主靶向抗病毒藥物（HTA）靶點(diǎn)：RNF6作為保守的宿主因子，為開(kāi)發(fā)廣譜抗ZIKV藥物提供新靶點(diǎn)
人源化研究基礎(chǔ)：分子對(duì)接顯示人源和樹(shù)鼩RNF6共享NS5結(jié)合位點(diǎn)（Gln-59,? ? Arg-140），支持向人類細(xì)胞模型轉(zhuǎn)化的可行性
4. 方法學(xué)意義
樹(shù)鼩模型應(yīng)用拓展：證明樹(shù)鼩作為非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的有效性，為其他病毒感染研究提供范式
CRISPR篩選策略優(yōu)化：正選擇策略（positive? ? selection）有效鑒定依賴性宿主因子
總結(jié)
英格恩轉(zhuǎn)染試劑在本研究中成功應(yīng)用于siRNA介導(dǎo)的基因敲低和CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為驗(yàn)證RNF6作為ZIKV前病毒宿主因子提供了可靠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)支持。該研究不僅建立了首個(gè)樹(shù)鼩全基因組CRISPR篩選平臺(tái)，更重要的是發(fā)現(xiàn)了RNF6這一新型宿主因子，為理解ZIKV跨越血腦屏障的分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)宿主靶向抗病毒策略提供了重要理論依據(jù)。
