作者，Evil Genius
歡迎來到大齡剩男相親記，昨天下午7點多見了一個女醫(yī)生，我覺得我自己就比較現(xiàn)實了，她更現(xiàn)實，著急的，實際上她94年的，我覺得不用急，結(jié)果她把醫(yī)學(xué)報告拿出來了，讓我看，告訴我女性超過30歲生孩子風(fēng)險急劇升高，超過33歲生下的孩子是弱智的概率大大提升，然后說男女都一樣，超過30歲細(xì)胞有絲分裂開始不穩(wěn)定，女性一生大概400個卵子，但是只有前面的200個左右是高質(zhì)量的，男性精子的數(shù)量和質(zhì)量從28歲左右開始下降，再加上現(xiàn)在生活壓力比較大，男性在抽煙喝酒熬夜等，這個生理只會提前。
說實話，我第一次見女方這么說。
還記得在上海的時候，女人都認(rèn)為35歲之前都算小呢，40歲生孩子也不晚。
對于單細(xì)胞空間如何走向臨床，其實是一個很深的課題，畢竟轉(zhuǎn)錄組層面不是根本，只是表象，但是空間排布確實反映了很多臨床信息，在臨檢公司看病理切片是一個非常專業(yè)且很大的部門。
衡量靶藥是否有效，目前最常見的辦法還是做NGS，但是空間病理信息也不可或缺，那么從研究的角度看，需要制定策略以更好地確定哪些患者將從治療中受益，哪些患者可能需要化療或放療等額外治療來克服耐藥性，尤其是免疫療法。那么借助單細(xì)胞+空間的力量，也許可以深入并克服這一點。
免疫療法僅在某些癌癥組織中取得成功，即使在這些類型中，也不是所有患者都能獲得臨床益處。在乳腺癌中，缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子2蛋白表達(dá)的三陰性乳腺癌亞型(TNBC)是最具免疫應(yīng)答性的亞型，也是唯一將免疫檢查點抑制(ICI)作為標(biāo)準(zhǔn)治療的亞型。然而，即使在TNBC中，在轉(zhuǎn)移情況下，單一治療ICI的客觀反應(yīng)率僅為~20%，因此后續(xù)研究僅追求ICI聯(lián)合化療和放療(RT)。這表明需要更好地了解腫瘤免疫微環(huán)境(TME)如何決定反應(yīng)。
乳腺腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞表現(xiàn)出巨大的異質(zhì)性，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)豐度與化療和ICI反應(yīng)相關(guān)。在乳腺癌和其他癌癥中，研究使用了CyTOF、bulk RNA測序(RNA-seq)和單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)來表征ICI之前的TME，并將各種免疫譜與反應(yīng)聯(lián)系起來。
治療前TME中的細(xì)胞相互作用也可能控制ICI反應(yīng)。
scRNA + CODEX技術(shù)。
結(jié)果1、空間分析確定TNBC中復(fù)發(fā)的細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)
設(shè)計并實施了一項新輔助臨床試驗（NCT03366844）來研究pembro和局灶性放療聯(lián)合治療TNBC患者 。50例新診斷的患者術(shù)前接受pembrots，三周后對原發(fā)乳腺腫瘤進(jìn)行pembrots + RT(3組24 Gy, pembrots + RT)，然后繼續(xù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)治療化療，手術(shù)和RT，在手術(shù)時確定病理完全緩解(pCR)。淋巴結(jié)陽性患者經(jīng)細(xì)針穿刺或芯針活檢病理證實。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組部分：用磁分離CD45+和CD45-的活檢樣本活細(xì)胞的頂部和底部1/3部分進(jìn)行單細(xì)胞測序，CD45+樣本同時進(jìn)行配對T細(xì)胞受體（TCR）/B細(xì)胞受體（BCR）-seq。
空間蛋白組部分：剩余的1/3部分，福爾馬林固定，石蠟包埋，并使用CODEX平臺，根據(jù)scRNA-seq鑒定的細(xì)胞類型，用抗體panels進(jìn)行分析。
空間細(xì)胞類型的鑒定：經(jīng)典marker。
空間域分析：細(xì)胞類型被分組成空間受限的domain或“區(qū)”，在活檢中反復(fù)出現(xiàn)。為了使這一觀察標(biāo)準(zhǔn)化，作者開發(fā)并應(yīng)用了一種無偏機(jī)器學(xué)習(xí)方法來識別12個domain的空間細(xì)胞結(jié)構(gòu)檢測。d0、d1、d5和d11區(qū)上皮細(xì)胞占89%。有2個基質(zhì)區(qū)(d2和d10)和1個內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)(d7)。d9區(qū)以髓系細(xì)胞為主(78%)，部分CD4+ T細(xì)胞(CD4T, 11%)。d6區(qū)為CD20+ B細(xì)胞(10%)、CD4T細(xì)胞(13%)、CD8+ T細(xì)胞(CD8T, 18%)、骨髓細(xì)胞(19%)和基質(zhì)細(xì)胞(37%)的混合物。大多數(shù)CD138+漿細(xì)胞(95%)位于d8區(qū)，與上皮細(xì)胞、髓細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞(>10%)共存。d3區(qū)和d4區(qū)以淋巴細(xì)胞為主，d3區(qū)含CD4T最多(39%)和CD8T最多(41%)，d4區(qū)含B細(xì)胞最多(54%)。
結(jié)果2 、治療誘導(dǎo)應(yīng)答性TNBC免疫微環(huán)境的重塑
從不同治療時間節(jié)點中的空間樣本分析相對細(xì)胞比例(占總細(xì)胞的百分比)和細(xì)胞密度(每單位面積的細(xì)胞數(shù))。
- At baseline, total immune cell proportions did not distinguish response groups, though immune cell density was higher in responders
- B cell dominant district d4 was the only district higher in proportion and density in responders at baseline, but T cell rich d6 was also denser at this time。
- AUROC分析也發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢。在治療前，d4是唯一與應(yīng)答相關(guān)的區(qū)(AUROC > 0.75)，但在RTPD1治療后，所有免疫富集區(qū)(d3, d4, d6, d8和d9)按比例和密度在應(yīng)答者中富集。
結(jié)果3、單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析
342,749個CD45+細(xì)胞的配對scRNA-seq數(shù)據(jù)。Leiden聚類鑒定出B細(xì)胞/漿細(xì)胞、T細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和肥大細(xì)胞。還將B細(xì)胞/漿細(xì)胞、T細(xì)胞和骨髓細(xì)胞分亞群，并使用差異基因表達(dá)分析(DGEA)和CellTypist軟件來描述細(xì)胞表型。
T/NK-cells：8個subclusters，
sc-t1和 sc-t7：NK-like cells，marker為NKG7，KLRB1
sc-t2：naive CD4+ /CD8+ T cells
sc-t3：Tregs
sc-t5：follicular-helper T cells
sc-t4 and sc-t6：effector/exhausted CD8+ T cells
B cells/plasma cells亞類：CD20+ B cell (sc-b0, sc-b2)，7 SDC1+ (CD138) plasma cell clusters
Myeloid cells亞類：12個亞類
sc-m7：migratory DC
sc-m8 and sc-m9：‘‘DC1’’ and ‘‘DC2’’
相關(guān)性分析空間域富集的細(xì)胞類型（spearman）
結(jié)果4、效應(yīng)T細(xì)胞擴(kuò)增與抗原呈遞巨噬細(xì)胞相關(guān)
觀察新抗原反應(yīng)效應(yīng)CD8+ T細(xì)胞特征(“neoTCR8”)，發(fā)現(xiàn)sc-t4和sc-t6表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平，并且這種特征在應(yīng)答者的早期活檢中最高。僅在應(yīng)答者中，這些subcluster在pembroo后擴(kuò)張增加，其中sc-t6在RTPD1后持續(xù)擴(kuò)張。此外，在兩種治療活檢中，有反應(yīng)者的sc-16擴(kuò)增高于無反應(yīng)者。
通過研究空間域的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)，d3和d4在其空間模式上是相關(guān)的，d6也與這兩個區(qū)域以及基質(zhì)富集的d2和d10相關(guān)。d8區(qū)與其他區(qū)無空間聯(lián)系，而d9區(qū)與d3區(qū)和d6區(qū)均有空間聯(lián)系。這些區(qū)域間的空間相關(guān)性在反應(yīng)者和非反應(yīng)者之間沒有差異。
結(jié)果5、鑒定兩組具有不同免疫軌跡的responder groups
反應(yīng)性腫瘤在與反應(yīng)相關(guān)的空間因素上表現(xiàn)出異質(zhì)性。為了研究這一點，根據(jù)腫瘤在所有活檢中的最大CODEX區(qū)域代表性對腫瘤進(jìn)行了無偏聚類。腫瘤聚集成3組，大多數(shù)無應(yīng)答的腫瘤形成一個亞組，應(yīng)答的腫瘤形成兩個亞組。將響應(yīng)組subgroup1稱為R1，所有其他響應(yīng)組稱為R2，而所有無響應(yīng)組稱為NR。
R2與免疫檢查點抑制的典型反應(yīng)組的表達(dá)相似度低，R1惡性細(xì)胞在base時顯示出免疫治療響應(yīng)的特征
為了研究區(qū)域共定位對擴(kuò)展的影響，測量了所有CODEX圖像中每個區(qū)域的細(xì)胞密度，然后對位于相應(yīng)二元分布上的區(qū)域?qū)ο袼剡M(jìn)行分類。然后，將每個活檢中上象限的像素百分比與sc-t6擴(kuò)張相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)R2中d6/d9共密度與sc-t6擴(kuò)張之間存在唯一的顯著相關(guān)性。此外，對d6/d9共密度和sc-t6膨脹之間形成的雙變量分布進(jìn)行上象限富集分析發(fā)現(xiàn)，R1和R2總體上富集相似，但最大富集與R2 RTPD1活檢相對應(yīng)。
結(jié)果6、RT和抗PD-1對TNBC小鼠模型免疫微環(huán)境的影響
分析發(fā)現(xiàn)R1惡性細(xì)胞在base和pembro之后表達(dá)與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的癌癥基因特征，并且這些基因在RTPD1后的R2中被擴(kuò)增。此外，通過對區(qū)分每種腫瘤類型的基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，R1癌細(xì)胞在base和pembro之后具有更高的MHC I、MHC II和TAP相關(guān)基因表達(dá)，并且在一次或兩次活檢中，這些基因在R1正常上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。
結(jié)論
基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)和CODEX分析，研究免疫細(xì)胞與非免疫細(xì)胞在空間上的浸潤以及共定位情況。三陰性乳腺癌中顯示無應(yīng)答者（Non-responders）在治療前后均缺乏免疫浸潤，僅表現(xiàn)出治療引起的微弱免疫變化；響應(yīng)者Responding tumors表現(xiàn)出兩種響應(yīng)模式。在治療前可通過分類器進(jìn)行區(qū)分，其中一組在治療前表現(xiàn)出高的MHC表達(dá)、存在三級淋巴結(jié)構(gòu)，并表現(xiàn)出抗腫瘤免疫效能。另一組應(yīng)答者在基線時與無應(yīng)答者相似，只有在聯(lián)合治療后才會產(chǎn)生最大的免疫應(yīng)答，其特征是細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞和抗原呈遞髓細(xì)胞相互作用。并且這些空間互作關(guān)系也在小鼠模型上得到了驗證。
