參考：

本講 PPT 下載鏈接為：http://pan.baidu.com/s/1skJAaAx，密碼：ga2l
視頻鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/JLPQbgQKUpa4ONNhzURQxw

image.png

第一部分：ChIP-seq 簡介

image.png

• 首先了解兩個(gè)概念：

Cistrome: the set of cis-acting targets of a transacting factor on a genome scale.

Epigenome: a parallel to the word "genome"; the overall epigenetic state of a cell

• 一般的雙端測序，R1/R2 比對到兩條鏈上面。通過Flag 可以提取比對到正反鏈的read,使用基因組瀏覽器可視化得到兩個(gè)峰圖。

  （Tips:而ChIA-PET 也是雙端測序，但是R1/R2 可能同一條鏈)

  參考： 雙端測序中read1和read2的關(guān)系

  image.png

  image.png

image.png

image.png

• 張勇老師開發(fā)出第一個(gè)peak callling 工具（macs,現(xiàn)在更新到macs3，由師弟劉濤維護(hù)?。?/li>

image.png

• ChIP-exo ： 從5 -end 進(jìn)行酶切，提高TFBS分辨率,幾乎直接看peak,而不需要軟件找。

image.png

• iChIP : 對不同細(xì)胞進(jìn)行index,再進(jìn)行抗體富集，運(yùn)用到單細(xì)胞領(lǐng)域.

  image.png

• 不同的TF 結(jié)合模型：

  一般TF是sharp peak.

  image.png

第二部分：ChIP-seq 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

image.png

image.png

image.png

• 關(guān)于實(shí)驗(yàn)重復(fù)及其測序深度：

  • 以人類為例，一般對于轉(zhuǎn)錄因子達(dá)到20M，寬峰達(dá)到40M read 比較好。當(dāng)然read越多越好，但是read 不太多，足以檢測結(jié)合比較強(qiáng)的位點(diǎn)。
  • 重復(fù)的問題，由于剛開始的一些文章ChIP-seq沒有重復(fù)，帶了一個(gè)不好的頭，后面慢慢要求2-3個(gè)重復(fù)（2-3個(gè)質(zhì)量好的重復(fù)，不是做了3個(gè)重復(fù)就好）。
  image.png

• 對照組：一般來說Input 和IgG 有一個(gè)就行，對于一些特別容易富集的區(qū)域，也就是假陽性，可以通過對照組來過濾掉。

image.png

第三部分：檢測ChIP質(zhì)量

image.png

• 通過IGV瀏覽器查看peak 是否明顯

  image.png

• 通過計(jì)算Frip 值：不同的TF，F(xiàn)rip 大小不同，結(jié)合越強(qiáng)的位點(diǎn)，F(xiàn)rip 可能越高

  image.png

• 交聯(lián)系數(shù)：通過移動 計(jì)算正反鏈read 皮爾遜相關(guān)系數(shù)變化過程。

  • 高質(zhì)量的ChIP 正負(fù)鏈的peak ，移動到最大 重疊位置，相關(guān)系數(shù)最大，也就是圖中ChIP peak 位置。
  image.png

• 同時(shí)比較兩個(gè)peak高度值，計(jì)算差異倍數(shù)，得到NSC/RSC 結(jié)果.下圖左邊為質(zhì)量高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

image.png

• 同時(shí)計(jì)算Frip 和NSC關(guān)系，兩者之間存在明顯的聯(lián)系.也就是說Frip 高的NSC,RSC 往往也較高。

  image.png

• IDR 方法：此方法對于重復(fù)間質(zhì)量好的樣本，IDR可能效果好，否則滿足條件的peak 會很少。

  從B圖可知，20000左右的peak ,IDR （不可重復(fù)率）較低，也就是peak 很可信。

  image.png
  image.png

• 也可以通過peak 區(qū)域motif 富集情況，評價(jià)質(zhì)量好壞。

  image.png

• 通過序列保守型來看：也就是通過通過profile 圖反映出富集效果。

  image.png

第四部分：完成項(xiàng)目后，需要提交哪些數(shù)據(jù)

image.png

image.png

image.png

image.png

第五部分：分析流程

image.png

• 第一步：數(shù)據(jù)比對

image.png

• 下一步：peak calling

image.png

• 要發(fā)布的部分peak calling 工具

  image.png

• 下一步：差異peak 分析

  • 定性問題：通過設(shè)置閾值，對兩組sample進(jìn)行peak 差異位點(diǎn)分析。得到有無peak的差異結(jié)果，但是對于一些在閾值邊界的位置，可能得到的差異peak 位點(diǎn)，存在假陽性問題。
  • 定量問題：通過差異倍數(shù)，及其顯著性來判斷差異peak. 對于組蛋白修飾來說，修飾水平的高度和表達(dá)強(qiáng)弱有關(guān)系；但是對于轉(zhuǎn)錄因子來說，可能沒有太大影響。
  image.png

• 差異peak 目前的工具

image.png

• 下一步：peak注釋

  image.png

image.png

• 下一步：motif 分析

  image.png

• 目前的工具

  image.png

• 下一步：靶基因預(yù)測

  image.png

• 也可以嘗試對TF進(jìn)行敲除，過表達(dá)研究目標(biāo)基因.

  image.png

• 下一步：目標(biāo)基因GO注釋

  image.png

思考

• 感覺做差異分析時(shí)候，定量分析采取Deseq2 或者DiffBind 結(jié)果差別較大時(shí)候，不好判斷選擇哪一個(gè)工具result.

• 了解到ChIP-seq 靶基因?qū)ふ夜ぞ?。比如結(jié)合RNA-seq結(jié)果，判斷敲除TF,那些基因是差異基因。工具如BETA

  
  

歡迎大家評論留言，相互學(xué)習(xí)~