摘要

用熒光蛋白進(jìn)行基因標(biāo)記對(duì)于研究細(xì)胞蛋白的動(dòng)態(tài)特性至關(guān)重要。 CRISPR–Cas9技術(shù)可將熒光標(biāo)記插入任何目標(biāo)基因（gene of interest, GoI）實(shí)現(xiàn)融合蛋白的功能和生理表達(dá)。至關(guān)重要的是，仔細(xì)評(píng)估此類基因組編輯的細(xì)胞系，以防止由以下因素引起的脫靶效應(yīng)：（i）熒光蛋白的不正確插入；（ii）熒光蛋白對(duì)融合蛋白的干擾；或（iii）非特異性基因組CRISPR–Cas9對(duì)DNA的損害。在該協(xié)議中，我們提供了系統(tǒng)性的流程和逐步描述，便于大家生成和驗(yàn)證純合的熒光敲入細(xì)胞系。我們使用配對(duì)的Cas9(D10a)切口酶，通過(guò)同源性定向修復(fù)（HDR）將標(biāo)簽插入特定的基因組位點(diǎn)，且脫靶效應(yīng)降至最低。對(duì)每個(gè)細(xì)胞克隆進(jìn)行全基因組測(cè)序以檢查哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中發(fā)生的自發(fā)遺傳變異既費(fèi)時(shí)又昂貴。因此，我們已經(jīng)開發(fā)了一條有效的驗(yàn)證流程，包括連接PCR，Southern印跡分析，sanger測(cè)序，顯微鏡，Western分析和活細(xì)胞成像，以了解細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)。該協(xié)議需要6到9周。通過(guò)該方案，可以用熒光蛋白純合地標(biāo)記多達(dá)70％的靶基因，從而導(dǎo)致融合蛋白的生理水平和表型功能性表達(dá)。

介紹

為了研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)和功能，研究人員通常使用熒光標(biāo)記物標(biāo)記蛋白質(zhì)。 Mahen等人1揭示，在內(nèi)源基因組位點(diǎn)標(biāo)記蛋白是通過(guò)活細(xì)胞成像和生物物理方法研究融合蛋白定量特性的最佳選擇。為了反映蛋白質(zhì)在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的生理濃度并確保標(biāo)記的蛋白質(zhì)完全取代內(nèi)源蛋白質(zhì)的功能，必須使用熒光標(biāo)記所有等位基因。該協(xié)議描述了如何生成表達(dá)純合標(biāo)記蛋白質(zhì)的細(xì)胞系，以分析活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)組動(dòng)力學(xué)，并使用熒光相關(guān)光譜法校準(zhǔn)的4D活細(xì)胞成像系統(tǒng)地在四個(gè)維度上系統(tǒng)地定量繪制細(xì)胞蛋白質(zhì)組圖。我們以前曾將此協(xié)議與本期隨附論文中描述的協(xié)議一起使用2來(lái)生成細(xì)胞，以研究核孔裝配并分析活細(xì)胞中蛋白質(zhì)組動(dòng)力學(xué)2-4。

流程的發(fā)展

我們的基因組編輯方法基于Ran等人5和Trevino等人6描述的方法，這些方法使用Cas9切口酶在真核系統(tǒng)中進(jìn)行基因組編輯。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用于基因組編輯的所有核酸酶（例如，鋅指核酸酶（ZFN），轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶和CRISPR–Cas9）都會(huì)在特定的基因組位點(diǎn)觸發(fā)雙鏈DNA（dsDNA）斷裂。主要通過(guò)兩個(gè)DNA修復(fù)途徑修復(fù)：非同源末端連接（NHEJ）和HDR7。對(duì)于產(chǎn)生敲入細(xì)胞系，HDR對(duì)于插入目標(biāo)標(biāo)簽至關(guān)重要。這是在dsDNA break5,8-16期間存在外源引入的修復(fù)模板才可完成的。 CRISPR–Cas9系統(tǒng)由野生型（wt）Cas9或突變型Cas9組成，分別在小向?qū)NA（gRNA）的引導(dǎo)下引入dsDNA斷裂或單鏈DNA切口。我們已使用配對(duì)的Cas9 D10A切口酶方法，以特定的驗(yàn)證流程以中等通量方式生成了純合標(biāo)記的目的基因，如本協(xié)議中所述。配對(duì)的Cas9D10A切口酶方法將Cas9切口酶突變體（D10A）與靶向目標(biāo)區(qū)域的有義和反義DNA鏈的成對(duì)gRNA結(jié)合在一起，以引入靶向的雙鏈斷裂5、6、10、17，在存在含有熒光標(biāo)記的DNA模板時(shí)會(huì)產(chǎn)生HDR。這種方法是生成內(nèi)源標(biāo)記細(xì)胞系的最合適方法，因?yàn)樗苊饬嗣摪行?yīng)，同時(shí)為生成內(nèi)源標(biāo)記細(xì)胞系提供了有效的DNA修復(fù)6,16-20（圖1）。我們已經(jīng)使用配對(duì)的Cas9D10A切口酶方法常規(guī)生成了純合的敲入細(xì)胞系，與純ZFN時(shí)的46％相比，純合子的敲入細(xì)胞系產(chǎn)生了70％（數(shù)據(jù)未顯示）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，成對(duì)的Cas9D10A切口酶方法更易受HDR影響，正如Bothmer等人18和Miyaoka等人19所表明的那樣，這很可能導(dǎo)致純合效率提高（請(qǐng)參閱“與其他方法的比較”部分”以獲取更多詳細(xì)信息）。

有幾例報(bào)道抑制NHEJ修復(fù)途徑來(lái)增加HDR和隨后的純合性[21-26]。 但是，通過(guò)RNA干擾DNA連接酶4（LIG4）或X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白4（XRCC4）耗盡后我們沒(méi)有觀察到純合性的實(shí)質(zhì)性改善（數(shù)據(jù)未顯示）。 同樣，我們發(fā)現(xiàn)添加NHRJ修復(fù)途徑抑制劑Scr7不會(huì)增加純合子的可能性，這證實(shí)了Greco等人的數(shù)據(jù)26（數(shù)據(jù)未顯示）。 破壞DNA的試劑可損害有絲分裂27，并且因?yàn)槲覀冎饕芯坑薪z分裂蛋白，所以我們不想破壞DNA修復(fù)途徑的機(jī)制，以防影響細(xì)胞周期。

幾項(xiàng)研究已經(jīng)研究了NHEJ和HDR在人類細(xì)胞的細(xì)胞周期中對(duì)DNA的修復(fù)作用28-30。在細(xì)胞周期中，G1期幾乎不存在同源重組，但S期最活躍。因此，我們?cè)诩?xì)胞轉(zhuǎn)染前24-48 h剝奪血清，使細(xì)胞部分同步于G1期。然后，在靶向dsDNA斷裂期間，我們將細(xì)胞釋放到S期，以增加存在修復(fù)模板時(shí)HDR的機(jī)會(huì)。對(duì)于某些基因靶標(biāo)，這種方法導(dǎo)致純合子的輕微增加，最高可達(dá)2％，但不是全部（數(shù)據(jù)未顯示）。盡管這只是純合性的少量增加，但是我們盡可能進(jìn)行血清剝奪，因?yàn)閷?duì)于某些目標(biāo)蛋白（POI），只有少數(shù)克隆被純合標(biāo)記。

當(dāng)熒光蛋白（FP）標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)和大小擾亂融合蛋白的功能時(shí)，純合標(biāo)簽對(duì)于某些必需蛋白是不可行的。因此，某些基因只能被雜合標(biāo)記。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)系統(tǒng)性cDNA標(biāo)記工作的數(shù)據(jù)，約25％的人類基因無(wú)法用FPs功能標(biāo)記。

仔細(xì)驗(yàn)證基因組編輯的細(xì)胞系對(duì)于控制脫靶效應(yīng)至關(guān)重要，這可能是由于在基因組中其他位置插入FP標(biāo)簽，F(xiàn)P對(duì)融合蛋白的干擾或gRNA的非特異性結(jié)合造成的非特異性DNA損傷而引起的，導(dǎo)致dsDNA斷裂和基因組重排。 Landry等人[32]證明，HeLa Kyoto細(xì)胞等細(xì)胞系的基因組不穩(wěn)定，可能導(dǎo)致自發(fā)突變。此外，每個(gè)細(xì)胞克隆的全基因組測(cè)序（每個(gè)候選對(duì)象最多50個(gè)細(xì)胞克?。┘劝嘿F又費(fèi)時(shí)。當(dāng)使用非癌細(xì)胞系時(shí)，考慮僅使用少數(shù)經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的細(xì)胞克隆進(jìn)行全基因組測(cè)序是合理的。許多標(biāo)記細(xì)胞系的生成通常是研究細(xì)胞內(nèi)的途徑或蛋白質(zhì)復(fù)合物和網(wǎng)絡(luò)所必需的。因此，我們建立了用于基因組編輯細(xì)胞系的驗(yàn)證管道，其中在工作流程的每個(gè)級(jí)別上都進(jìn)行了有效的質(zhì)量控制（圖2），以確保保留每個(gè)POI的高質(zhì)量純合和雜合細(xì)胞克隆并用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。如果僅產(chǎn)生了雜合標(biāo)記的克隆，則對(duì)這些克隆進(jìn)行第二輪基因組編輯以實(shí)現(xiàn)純合。另外，由于dsDNA斷裂而沒(méi)有重組(產(chǎn)生mutation)，雜合標(biāo)記的克隆在未標(biāo)記的等位基因中可能喪失功能，這可能導(dǎo)致偽純合細(xì)胞克隆僅表達(dá)重組的等位基因中的標(biāo)記融合蛋白。工作流程中每個(gè)步驟的詳細(xì)信息將在“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”部分中進(jìn)行討論。

應(yīng)用領(lǐng)域

可以使用此協(xié)議標(biāo)記任何POI。 我們小組的主要興趣是參與細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期控制的蛋白質(zhì)的。 因此，該協(xié)議包含一個(gè)細(xì)胞周期分析步驟。 如果標(biāo)記了其他信號(hào)通路的蛋白質(zhì)，則可能需要進(jìn)行其他分析，或者可以自行修改“細(xì)胞周期分析”部分。

只要需要保持標(biāo)記蛋白的生理表達(dá)水平及其功能性的標(biāo)記蛋白，內(nèi)源標(biāo)記細(xì)胞均可用于任何應(yīng)用。

限制

按本方法操作70％的靶向基因被FPs純合標(biāo)記，且融合蛋白按生理水平和表型功能表達(dá)。 但某些蛋白質(zhì)不能被純合標(biāo)簽，因?yàn)镕P標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)和大小會(huì)擾亂融合蛋白的功能。 因此某些基因只能雜合標(biāo)記。 此外，還應(yīng)考慮要表達(dá)的POI分子的豐度，因?yàn)樵诒磉_(dá)少量標(biāo)記蛋白時(shí)某些方法存在檢測(cè)極限(目標(biāo)蛋白太少檢測(cè)不到)。

與其它方法比較

CRISPR–Cas9技術(shù)發(fā)展迅速。主要問(wèn)題之一是脫靶效應(yīng)，通過(guò)使用配對(duì)的Cas9D10A切口酶可以大大降低脫靶效應(yīng)。此外，據(jù)報(bào)道轉(zhuǎn)染預(yù)先形成的Cas9 gRNA復(fù)合物（Cas9核糖核蛋白（Cas9RNP））可提高基因敲除的效率，并且脫靶效應(yīng)33-35。然而，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，使用Cas9RNP或mRNA而不是質(zhì)粒表達(dá)Cas9蛋白并不能提高人細(xì)胞系中純合敲入的效率（數(shù)據(jù)未顯示），反而很大程度上導(dǎo)致了雜合標(biāo)記的基因。 Roberts等人36還報(bào)告了在人類干細(xì)胞中使用CRISPR–Cas9RNP進(jìn)行系統(tǒng)性基因標(biāo)記的方法中僅雜合標(biāo)記的基因。但是，此協(xié)議的應(yīng)用是執(zhí)行定量FCS校準(zhǔn)的活細(xì)胞成像（請(qǐng)參閱本期隨附的協(xié)議4）。這依賴于純合的熒光標(biāo)記蛋白。因此，具有當(dāng)前性能的Cas9RNP方法目前不適合該管道。

Paix等[37]證明具有短同源臂的線性DNA可用作DNA修復(fù)模板，可用于基因組編輯敲入方法。我們能夠使用由mEGFP組成的雙鏈線性DNA模板，其側(cè)翼為短50 bp的同源臂，但只能產(chǎn)生雜合的敲入細(xì)胞系，而不會(huì)產(chǎn)生純合的敲入（數(shù)據(jù)未顯示）。

Paquet等[38]表明，通過(guò)Cas9RNP使用單鏈寡核苷酸供體（ssODN）進(jìn)行純合突變導(dǎo)入，需要靶向接近預(yù)期突變的gRNA。在我們的實(shí)驗(yàn)方案中，gRNA的位置也靠近或應(yīng)該插入標(biāo)簽的目標(biāo)位置，因此在熒光標(biāo)記或其他標(biāo)簽（例如Halo或SNAP）的純合導(dǎo)入中具有良好的效率。感興趣的地點(diǎn)。但是，我們必須通過(guò)質(zhì)粒供體引入一個(gè)約700-750 bp的熒光標(biāo)簽，因此，我們不能像Paquet等[38]所描述的那樣使用ssODN。如上所述，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，盡管雜合標(biāo)簽是可能的，但結(jié)合質(zhì)粒DNA作為供體的Cas9RNP方法并不成功。

總而言之，目前此方案中所述的基于配對(duì)Cas9D10切口酶質(zhì)粒的方法仍然是敲入人細(xì)胞系生成具有純合熒光基因的最佳程序。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

gRNA和供體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)

gRNA和供體的設(shè)計(jì)取決于POI的標(biāo)記位置，通常在N或C末端。 謹(jǐn)慎地進(jìn)行擴(kuò)展文獻(xiàn)搜索以查找定位數(shù)據(jù)，對(duì)POI標(biāo)記版本進(jìn)行功能研究以及其他物種（如酵母或小鼠）中的表達(dá)數(shù)據(jù)，以洞悉可以標(biāo)記POI的哪個(gè)末端，同時(shí)保持其功能和定位的正確。

種子區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)突變，即原間隔鄰近基序（PAM）10-12個(gè)堿基以內(nèi)的序列，可降低gRNA結(jié)合活性39。 因此，所用細(xì)胞系的序列變異（例如單核苷酸多態(tài)性（SNP））與參考基因組不同，GOI的同工型可能會(huì)干擾CRISPR–Cas9靶向。 因此，建議不僅在用于標(biāo)記的GOI區(qū)域內(nèi)而且還要對(duì)可能的同工型進(jìn)行測(cè)序。

gRNA應(yīng)直接結(jié)合靶位點(diǎn)，例如開放閱讀框的起始或終止密碼子。 HDR最好在dsDNA斷裂位點(diǎn)100 bp內(nèi)。此范圍外，HDR的效率下降了四倍9。使用Cas9D10A切口酶時(shí)，需要兩個(gè)gRNA，一個(gè)用于反義，一個(gè)用于有義DNA鏈。將適當(dāng)設(shè)計(jì)的gRNA6、9、17、18作為退火的寡核苷酸插入包含兩個(gè)表達(dá)盒，人密碼子優(yōu)化的Cas9D10切口酶和gRNA的Cas9 / gRNA表達(dá)質(zhì)粒中。

供體質(zhì)粒含有進(jìn)行同源重組的模板和熒光標(biāo)記基因（例如，mEGFP或mCherry），所述熒光標(biāo)記基因的側(cè)翼與GOI的靶位點(diǎn)具有500至800bp的同源臂。

熒光標(biāo)記替換起始密碼子或終止密碼子，并與GOI一致。默認(rèn)情況下，標(biāo)簽和基因之間應(yīng)該有一個(gè)短的柔性接頭，以改善標(biāo)簽蛋白的功能。供體質(zhì)粒不應(yīng)含有外源啟動(dòng)子或哺乳動(dòng)物選擇標(biāo)記，避免靶基因未發(fā)生重組而具有選擇標(biāo)記。質(zhì)粒的遞送方法取決于所選的細(xì)胞系而進(jìn)行優(yōu)化。 HeLa Kyoto細(xì)胞可通過(guò)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染進(jìn)行很好的轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染可用于在此方案中生成內(nèi)源標(biāo)記的細(xì)胞系。

熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞克隆的熒光激活細(xì)胞分選

供體質(zhì)粒用作DNA修復(fù)模板。 BacORI是在大腸桿菌中復(fù)制質(zhì)粒必不可少的，但含有隱蔽的啟動(dòng)子區(qū)域。細(xì)胞中只要有該質(zhì)粒，就可以在基因組整合之前產(chǎn)生某些背景表達(dá)40。因此，在轉(zhuǎn)染后7-10 d進(jìn)行單細(xì)胞分選以選擇熒光細(xì)胞，從而減少了熒光激活細(xì)胞分選（FACS）期間假陽(yáng)性細(xì)胞克隆的數(shù)量。根據(jù)選擇的FACS后細(xì)胞系中單細(xì)胞的存活率，應(yīng)分類數(shù)百個(gè)單細(xì)胞克隆以進(jìn)行下游鑒定。通常，必須針對(duì)每種親本細(xì)胞系優(yōu)化單細(xì)胞克隆的最佳生長(zhǎng)條件。該協(xié)議中的條件已針對(duì)廣泛使用的HeLa Kyoto細(xì)胞進(jìn)行了優(yōu)化。 HeLa Kyoto wt細(xì)胞用作陰性對(duì)照，以區(qū)分非特異性和特異性FP / mEGFP表達(dá)水平。

用DAKO MoFlo高速分選儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，并通過(guò)EMBL的流式細(xì)胞術(shù)核心設(shè)施（Heidelberg；圖3）進(jìn)行分選。設(shè)置和校準(zhǔn)如下：BD FACSFlow被用作鞘液。該儀器裝有一個(gè)100 μm的噴嘴頭，液滴的產(chǎn)生頻率約為40 kHz。初級(jí)激光是調(diào)諧到單線488 nm 200 mW輸出功率（通過(guò)50/50分束器后撞擊細(xì)胞的100 mW單相干Saber氬離子激光器）。該激光器用于產(chǎn)生前向和側(cè)向散射（分別為FSC和SSC），以及用于激發(fā)GFP。次級(jí)激光器是相干馬刀K離子激光器。在mCherry的激發(fā)中將其調(diào)諧至568 nm（200 mW）的單線，在Cerulean的激發(fā)中將其調(diào)諧至多線紫（MLVio：406.7–415.4 nm）。激光束已仔細(xì)對(duì)準(zhǔn)MoFlo的主要光路。在運(yùn)行Flow-Check熒光球期間，可以優(yōu)化光路的對(duì)準(zhǔn)。樣品事件是在液滴占比小于25％的情況下獲得的。樣品-護(hù)套的壓差低，無(wú)法將細(xì)胞限制在同軸流的中心，因此限制了光照變化。排序決策門基于在多個(gè)2D圖中圍繞目標(biāo)人群繪制的區(qū)域的組合：FSC面積與SSC面積； FSC面積與FSC脈沖寬度和熒光的關(guān)系。在將分類目標(biāo)細(xì)胞克隆到含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的96孔板的過(guò)程中，使用了一個(gè)一滴模式。使用Moflo Summit軟件和FlowJo（Tree Star）軟件分析數(shù)據(jù)。

內(nèi)源性標(biāo)記蛋白的熒光信號(hào)取決于它們的生理表達(dá)水平，與常用的過(guò)表達(dá)系統(tǒng)相比通常相對(duì)暗淡，必須使用高靈敏度的FACS分選儀。 對(duì)于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的蛋白，可能還需要在特定的細(xì)胞周期階段同步細(xì)胞，以使細(xì)胞富集FACS信號(hào)。 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后7-10 d陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的效率介于0.05％和10％之間（例如，圖3），但通常約為0.5％。 HeLa Kyoto wt細(xì)胞用作陰性對(duì)照并定義背景信號(hào)（圖3，上圖； HeLa細(xì)胞，0.04％GFP陽(yáng)性），并相應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性GFP細(xì)胞的門。 對(duì)于mEGFP-NUP358，獲得了1.76％的mEGFP-NUP358陽(yáng)性細(xì)胞（圖3，下圖； mEGFP-NUP358），并分入96孔板中。

連接PCR

可以使用結(jié)合在基因組基因座中同源臂外部和重組熒光標(biāo)簽內(nèi)的引物，通過(guò)PCR檢測(cè)熒光標(biāo)記物是否正確整合到預(yù)期的基因座中（圖4a）。 為了確定所有等位基因是否都被熒光標(biāo)記標(biāo)記（純合性），使用位于左右同源臂外側(cè)的引物。 所得的一種或兩種PCR產(chǎn)物分別表示純合或雜合。 但由于兩種PCR產(chǎn)物之間的競(jìng)爭(zhēng)，可能無(wú)法檢測(cè)到雜合克隆中的標(biāo)記基因（圖4b）。 因此，建議在同源臂內(nèi)用引物重復(fù)連接PCR，這會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物縮短（圖4c）并改善兩種PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。 但是，當(dāng)使用目標(biāo)位點(diǎn)的GOI引物時(shí)，純合標(biāo)記的基因?qū)⑹冀K僅產(chǎn)生一種PCR產(chǎn)物（圖4，克隆號(hào)97）。

sanger測(cè)序

用靶區(qū)域周圍的引物進(jìn)行PCR，然后進(jìn)行Sanger測(cè)序41,42，以檢測(cè)基因組位點(diǎn)標(biāo)簽插入位點(diǎn)內(nèi)的突變。親代wt細(xì)胞和供體質(zhì)粒的序列用作參考。圖5顯示了一個(gè)測(cè)序?qū)嵗?，隨后進(jìn)行比對(duì)分析。兩個(gè)不同的表達(dá)mEGFP–NUP358的HeLa Kyoto細(xì)胞克隆純合（圖5，tagged 97）或雜合（圖5，tagged 118和untagged 118）與mEGFP–NUP358供體質(zhì)粒和HeLa Kyoto wt序列比對(duì)。 HeLa Kyoto wt和未加標(biāo)簽的118個(gè)不包含預(yù)期的mEGFP，但是在編號(hào)內(nèi)有一個(gè)缺失（63 nt）。未標(biāo)記的NUP358的第一個(gè)外顯子缺失6個(gè)氨基酸（圖5，untagged 118號(hào)）。但是，同一克隆的mEGFP–NUP358（圖5，tagged 118）是正確的，并且mEGFP的整合在插入位點(diǎn)（圖5，tagged 118）沒(méi)有任何突變，正如預(yù)期的那樣。純合子克隆97僅包含標(biāo)記的mEGFP– NUP358，從而將mEGFP正確插入目標(biāo)位點(diǎn)（圖5，tagged 97的位置）。因此，mEGFP已正確插入NUP358的N末端，該純合標(biāo)簽的克隆可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

另外，如果在第一輪基因組編輯之后僅存在雜合細(xì)胞克隆，則對(duì)雜合細(xì)胞克隆的所有未標(biāo)記等位基因進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)靶區(qū)域內(nèi)可能的突變。這很重要，因?yàn)辄c(diǎn)突變可能會(huì)阻礙第二輪基因組編輯的gRNA結(jié)合。由于FP的結(jié)構(gòu)和大小，某些蛋白質(zhì)無(wú)法被純合標(biāo)簽，這會(huì)干擾蛋白質(zhì)的功能。

Southern印跡分析

Southern印跡分析對(duì)于顯示純合性和排除標(biāo)簽的脫靶整合非常重要。針對(duì)該標(biāo)簽的探針應(yīng)僅在Southern印跡上產(chǎn)生一種預(yù)期的產(chǎn)物（圖6，GFP探針，mEGFP– NUP358）。但是，在某些情況下，會(huì)檢測(cè)到其他DNA片段，這表明供體質(zhì)粒的隨機(jī)整合或dsDNA斷裂后由于基因組重排而引起的其他脫靶效應(yīng)（圖6，GFP探針，綠色星號(hào)）。也可以插入多個(gè)mEGFP標(biāo)簽如克隆1和18所示（圖6，GFP和NUP358印跡，克隆1和18，綠色星號(hào)），導(dǎo)致標(biāo)記的DNA片段發(fā)生移位。隨機(jī)插入的標(biāo)簽的表達(dá)應(yīng)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行徹底研究，因?yàn)槎嘤嗟腇P會(huì)干擾下游實(shí)驗(yàn)（如定量活細(xì)胞成像）的結(jié)果4。

與同源臂外的內(nèi)源目的位點(diǎn)結(jié)合的探針可檢測(cè)雜合性和純合性（圖6，NUP358探針，Nup358和mEGFP–NUP358）。純合子克隆僅產(chǎn)生一種預(yù)期產(chǎn)物，其大小與針對(duì)該標(biāo)簽的探針相同（圖6，克隆編號(hào)97），而雜合子克隆有兩種產(chǎn)物，一種用于標(biāo)記的基因，一種用于未標(biāo)記的基因（圖6 克隆號(hào)118）。感興趣的內(nèi)源基因座內(nèi)可能發(fā)生重排，并通過(guò)額外的意外條帶檢測(cè)到（圖6，NUP358探針，紅色星號(hào)）。此外，某些樣本（例如克隆26和27）可以顯示出帶有標(biāo)簽GOI較小尺寸的產(chǎn)品，這與預(yù)期的一樣，這可能是由于該區(qū)域內(nèi)的缺失所致。

綜上所述，沒(méi)有額外的意外DNA片段的克隆將用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

蛋白質(zhì)印跡分析

熒光標(biāo)記的蛋白的表達(dá)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)一步表征（圖7）。 FP抗體（例如抗GFP）以預(yù)期的大小將標(biāo)記的POI的特異性表達(dá)檢測(cè)為特定條帶（圖7，上圖，抗GFP，mEGFP–NUP358 = 385 kDa）。當(dāng)將供體質(zhì)粒插入常染色質(zhì)區(qū)域時(shí)，其隨機(jī)整合可引起游離FP的表達(dá)，可檢測(cè)到27kDa蛋白帶。在HeLa對(duì)照樣品中可見一個(gè)弱的非特異性條帶，大小與游離GFP相同，進(jìn)而會(huì)干擾游離GFP的檢測(cè)。該非特異性條帶最有可能是由于抗體的非特異性，這可以通過(guò)使用不同的抗體來(lái)解決。測(cè)試了來(lái)自多家公司（例如Abcam，Santa Cruz Biotechnology，Rockland和MBLand Roche）的GFP抗體，發(fā)現(xiàn)由Roche產(chǎn)生的GFP抗體最敏感，最特異性。但是，HeLa Kyoto mEGFP–NUP358克隆26和122似乎表達(dá)少量的游離mEGFP，因?yàn)槭褂肎FP抗體可檢測(cè)到較HeLa Kyoto wt細(xì)胞高的27 kDa的條帶（圖7，上圖，抗GFP）。

游離FP的表達(dá)可能會(huì)干擾蛋白質(zhì)表征實(shí)驗(yàn)，例如定量活細(xì)胞成像。表達(dá)游離GFP的克隆不可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。利用蛋白質(zhì)印跡分析內(nèi)源引入的標(biāo)簽也可用于檢測(cè)其他游離FP /標(biāo)簽的表達(dá)。

如Mahen等人1所示，針對(duì)POI的特異性抗體（如果可用）對(duì)于區(qū)分純合和雜合克隆非常有用。 但是，在mEGFP–NUP358的情況下，這是不可行的，因?yàn)榈鞍状?，無(wú)法通過(guò)常規(guī)蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)到358 kDa的未標(biāo)記NUP358和385 kDa的標(biāo)記的mEGFP–NUP358之間的差異。

細(xì)胞周期分析

在基因組編輯過(guò)程后，細(xì)胞周期可能會(huì)受到標(biāo)簽或脫靶效應(yīng)的影響。我們小組的主要興趣是參與細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期控制的蛋白質(zhì)的表征。因此，我們建立了由自動(dòng)延時(shí)顯微鏡和分析組成的自動(dòng)化工作流程，以一次測(cè)量許多細(xì)胞的細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)（圖8）。可以使用帶有適當(dāng)標(biāo)記物的高通量顯微鏡對(duì)其他感興趣的細(xì)胞功能進(jìn)行類似的測(cè)定。

首先，將細(xì)胞核用SiR-DNA染色以確定每個(gè)單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞周期狀態(tài)。隨后，每5分鐘執(zhí)行一次自動(dòng)活細(xì)胞成像，持續(xù)24小時(shí)（圖8a）。圖像被自動(dòng)分析追蹤單個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)相間和有絲分裂細(xì)胞并測(cè)量有絲分裂時(shí)間（圖8b，c）。例如，測(cè)量從前期開始到后期開始的有絲分裂時(shí)間（圖8c）并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估（圖8d）。將有絲分裂的持續(xù)時(shí)間與wt細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間進(jìn)行比較。丟棄具有明顯延長(zhǎng)的細(xì)胞克?。▓D8d，mEGFP-CDC20，克隆140）和縮短的有絲分裂時(shí)間（圖8d，mEGFP-Bub3，克隆74）。

分析每個(gè)標(biāo)記基因的所有細(xì)胞克隆的有絲分裂時(shí)間。例如，HeLa Kyoto mEGFP–NUP358細(xì)胞的所有克隆在有絲分裂期間均表現(xiàn)為HeLa Kyoto wt細(xì)胞（圖9），這證實(shí)了它們?cè)谥T如FCS校準(zhǔn)的4D活細(xì)胞成像2,4等未來(lái)實(shí)驗(yàn)中的用途。

必需的對(duì)照

內(nèi)源性標(biāo)記POI的優(yōu)勢(shì)在于，標(biāo)記的蛋白不僅保留其生理表達(dá)水平，而且還保留其功能。但是，可能的脫靶效應(yīng)和使用的FP可能會(huì)影響這一點(diǎn)。因此，必須開發(fā)驗(yàn)證工作流程來(lái)分析POI的正確表達(dá)和功能。

在生成和驗(yàn)證工作流程中，需要考慮幾個(gè)控件。對(duì)照完全按照樣品準(zhǔn)備。每個(gè)驗(yàn)證步驟中每個(gè)樣品/對(duì)照的制備在“程序”部分中有詳細(xì)說(shuō)明；在這里，我們提供所需控件的摘要。

gRNA功能測(cè)試的陰性對(duì)照是未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照是已驗(yàn)證的gRNA對(duì)（步驟26）。陰性對(duì)照的PCR產(chǎn)物帶應(yīng)只有一個(gè)條帶，而用T7E1消化的配對(duì)切口酶樣品應(yīng)具有預(yù)期的幾個(gè)切割帶。 T7E1分析的替代方法是TIDE。 TIDE包括目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增，Sanger測(cè)序和通過(guò)專門開發(fā)的分解算法對(duì)序列痕跡進(jìn)行分析，該算法可識(shí)別計(jì)劃的編輯位點(diǎn)中的主要誘導(dǎo)突變并準(zhǔn)確確定其在細(xì)胞群體中的頻率43。

FACS期間內(nèi)源標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平可能非常低。因此，必須使用HeLa Kyoto wt細(xì)胞作為陰性對(duì)照來(lái)區(qū)分非特異性和特異性FP / mEGFP表達(dá)水平（步驟42）。

來(lái)自親本細(xì)胞系（例如HeLa Kyoto）和水的基因組DNA可用作陰性對(duì)照，以驗(yàn)證標(biāo)簽在正確位點(diǎn)的整合并通過(guò)連接PCR測(cè)試純合性（步驟48A）。

從親本細(xì)胞系（例如HeLa Kyoto細(xì)胞）制備的基因組DNA可用作Southern印跡分析（步驟48B）和Sanger測(cè)序（步驟48C）中的陰性對(duì)照，以區(qū)分標(biāo)記的DNA和未標(biāo)記的DNA。

在蛋白質(zhì)印跡分析中，可將源自親本細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物用于比較未標(biāo)記蛋白和標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平（步驟48D）。

可以通過(guò)在固定細(xì)胞的顯微鏡檢查過(guò)程中使用針對(duì)POI的抗體來(lái)確認(rèn)標(biāo)記POI的正確定位（步驟49B）。

將內(nèi)源標(biāo)記細(xì)胞系的細(xì)胞周期與親代細(xì)胞（例如，HeLa Kyoto細(xì)胞）的細(xì)胞周期時(shí)序進(jìn)行了比較（專欄1）。

與內(nèi)源標(biāo)記的POI相比，親本細(xì)胞系中POI的表達(dá)和功能至關(guān)重要。但是，如果POI未知，將很難評(píng)估這些方面，并且可能必須生成一些工具，例如抗體。

材料

試劑

gRNA克隆

T7E1

細(xì)胞培養(yǎng)

轉(zhuǎn)化

FACS

連接PCR

Southern Blot

sanger測(cè)序

Western Blot

活細(xì)胞和細(xì)胞周期分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

gRNA設(shè)計(jì) - 1d

gRNA設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)一對(duì)gRNA，一個(gè)與反義鏈結(jié)合，另一個(gè)與有義鏈結(jié)合，以使其中一個(gè)與目標(biāo)位點(diǎn)（例如ATG或終止密碼子）結(jié)合或盡可能接近。同源重組將最有效地發(fā)生在靶位點(diǎn)的100 bp之內(nèi)，并且在該區(qū)域之外效率顯著降低。使用http://crispr.mit.edu/或https://benchling.com/crispr9,44,45設(shè)計(jì)兩個(gè)不同的gRNA對(duì)?？扇萑痰拿摪袘?yīng)包含至少2個(gè)核苷酸不匹配且位于PAM序列的8-12 nt 5'種子區(qū)域內(nèi)。

設(shè)計(jì)用于gRNA克隆的寡核苷酸。使用BbsI消化pX335載體，并在gRNA支架之前將一對(duì)退火的寡核苷酸克隆到pX335載體中。根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)序列（20 bp）設(shè)計(jì)寡核苷酸，其中3 bp NGG PAM序列位于3'末端，但不包括PAM位點(diǎn)。如https://www.addgene.org/crispr/zhang/（表1）所述，我們向gRNA中添加了BbsI位點(diǎn)，以將寡核苷酸克隆到pX335載體中。

訂購(gòu)表1中所示的寡核苷酸。

供體的設(shè)計(jì)合成14–21 d

供體設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)供體質(zhì)粒DNA上熒光標(biāo)記基因（例如，編碼mEGFP或mCherry）兩側(cè)包含GOI兩側(cè)500至800 bp同源臂。熒光標(biāo)記替換起始密碼子或終止密碼子，并與GOI和內(nèi)源啟動(dòng)子一致。如果同源臂的末端富含GC或包含任何重復(fù)區(qū)域，則應(yīng)將其縮短；否則800 bp效果很好。標(biāo)簽和基因之間應(yīng)有l(wèi)inker維持標(biāo)簽蛋白的功能（可以使用5x甘氨酸或5x甘氨酸/絲氨酸重復(fù)序列）46；但是，如果有一個(gè)已知的linker已用于POI，則最好使用該linker。如果需要，在同源臂和插入物之間包含額外的克隆位點(diǎn)可以交換標(biāo)簽或linker（補(bǔ)充圖1）。如果必須標(biāo)記兩個(gè)POI，則應(yīng)使用mEGFP標(biāo)記表達(dá)最低的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗萴Cherry明亮且穩(wěn)定。使用單體熒光標(biāo)簽，例如mEGFP，mCherry或mCer3。供體的設(shè)計(jì)通常取決于gRNA，因?yàn)樗鼞?yīng)該與內(nèi)源基因不同。否則，gRNA也會(huì)切割供體，導(dǎo)致HDR效率降低。因此，最好在起始或終止密碼子之間使用gRNA（取決于N端或C端標(biāo)簽），以使供體由于插入標(biāo)簽而不同于內(nèi)源性基因組基因座。關(guān)鍵！供體質(zhì)粒中不含哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記。如果在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用抗生素選擇，則供體質(zhì)粒到細(xì)胞基因組中的隨機(jī)整合將增加。此外，供體質(zhì)粒內(nèi)不應(yīng)存在CMV，RSV或任何其他外源啟動(dòng)子；否則，標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)水平將不是生理性的，并且會(huì)出現(xiàn)偽影。

供體的基因合成。使用Geneart（Thermo Scientific）或Genewiz（Sigma-Aldrich）合成供體。關(guān)鍵！供體的合成可能需要長(zhǎng)達(dá)21天的時(shí)間，具體取決于同源臂中的G / C％和重復(fù)序列。在生產(chǎn)期間，進(jìn)行g(shù)RNA克隆和T7E1分析

將gRNAs克隆到pX335-u6-chimeric-bb-cbh-hspcas9n（D10a）載體 4 d

將每個(gè)gRNA寡核苷酸的正向和反向鏈重懸至ddH2O中的終濃度為100 μM。

100 μM正向和反向儲(chǔ)備液各4 μl混合均勻。

使用以下參數(shù)在熱循環(huán)儀中對(duì)正向和反向寡核苷酸（表1）進(jìn)行退火：95°C持續(xù)5分鐘，然后以0.1°C / s（?5°C / m）的斜率冷卻至25°C

結(jié)合以下成分，用BbsI（BpiI）消化pX335-U6-chimeric-BB-CBh-hSpCa9n（D10A）載體：

孵育后，將40 μl的消化產(chǎn)物中加入8 μl的6x上樣染料，在含SYBR Safe染料的TBE緩沖液中的1％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上樣，并在100 V下運(yùn)行約20分鐘。

根據(jù)供應(yīng)商手冊(cè)，使用QIAquick凝膠純化試劑盒純化8.4 kb的消化產(chǎn)物。 用30 μl EB緩沖液（試劑盒的一部分）洗脫DNA。

使用Roche快速連接試劑盒將退火的寡核苷酸連接到BbsI消化的pX335中。 準(zhǔn)備每個(gè)gRNA的寡核苷酸和用于以下連接反應(yīng)的無(wú)插入陰性對(duì)照：關(guān)鍵！在先前公布的方案9中，對(duì)退火的寡核苷酸進(jìn)行了磷酸化處理，并對(duì)載體進(jìn)行了去磷酸化處理，這可能導(dǎo)致假陽(yáng)性菌落數(shù)量增加或完全沒(méi)有菌落。 當(dāng)前的方案可靠地產(chǎn)生了正確插入gRNA寡核苷酸的陽(yáng)性菌落，盡管您可能會(huì)發(fā)現(xiàn)有時(shí)只產(chǎn)生幾個(gè)菌落。

-17轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒

測(cè)序確認(rèn)sgRNA正確插入質(zhì)粒

使用t7e1測(cè)試grnas功能 5 d

-22培養(yǎng)HeLa Kyoto細(xì)胞

在轉(zhuǎn)染前1 d，在2 ml正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的六孔細(xì)胞培養(yǎng)皿上每孔接種1.5×105個(gè)細(xì)胞，并在37°C，5％CO2下孵育1 d。轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞應(yīng)至少融合50％。

第二天，將gRNA質(zhì)粒在200 μl jetPrime緩沖液中稀釋，濃度如下表所示。

-32轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細(xì)胞提取基因組

Touchdown PCR。 設(shè)計(jì)引物最終產(chǎn)生的700至1,000 bp PCR產(chǎn)物。 通過(guò)CRISPR–Cas9成功切割此PCR產(chǎn)物應(yīng)產(chǎn)生兩個(gè)片段。 每個(gè)剪切片段應(yīng)為?300 bp，長(zhǎng)度應(yīng)相差100–200 bp，在2％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上產(chǎn)生兩個(gè)可檢測(cè)的條帶。 使用HotStar HighFidelity PCR試劑盒擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，并如下所述設(shè)置每個(gè)反應(yīng)：

使用以下循環(huán)條件放大目標(biāo)區(qū)域：

在2％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上跑2 μl PCR產(chǎn)物。 應(yīng)該存在一個(gè)擴(kuò)增片段。 將3 μl PCR產(chǎn)物放在冰上，以備以后在步驟36中進(jìn)行分析。

使用剩余的15 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行以下變性/再退火循環(huán)以生成異源雙鏈DNA：

通過(guò)添加1.8 μl 10×NEB緩沖液2和1.2 μl T7核酸內(nèi)切酶I消化15 μl異源雙鏈DNA。在37°C下孵育30分鐘。

在2％（wt / vol）瓊脂糖凝膠上分析18 μl T7E1消化產(chǎn)物。 運(yùn)行3 μl未消化的PCR產(chǎn)物以比較切割效率。 陰性對(duì)照的PCR產(chǎn)物帶應(yīng)只有一個(gè)條帶，而用T7E1消化的成對(duì)的雙切口酶樣品應(yīng)具有預(yù)期的幾個(gè)切割帶。 在步驟39中應(yīng)使用具有最高切割效率的gRNA對(duì)，將熒光標(biāo)記基因?qū)肽繕?biāo)基因座。

使用質(zhì)粒的配對(duì)CRISPR–Cas9方法 7–10 d

關(guān)鍵！CRISPR-Cas9配對(duì)方法已用于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系6、7、16-18。 必須優(yōu)化每個(gè)細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染條件。 下述條件最適合HeLa Kyoto細(xì)胞。

用gRNA和供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa Kyoto細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染前，在2毫升Opti-MEM I培養(yǎng)基的六孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每孔接種1.5×105個(gè)細(xì)胞，以使細(xì)胞饑餓。轉(zhuǎn)染前1 d在37°C，5％CO2下孵育細(xì)胞。轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞應(yīng)至少融合50％。關(guān)鍵！當(dāng)將細(xì)胞接種到無(wú)血清的培養(yǎng)基（如OptiMEM I）中時(shí)由于饑餓和G1阻滯，純合子產(chǎn)率可提高2％。因此，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后進(jìn)入S期。在細(xì)胞周期的這一階段同源重組更頻繁。

（第2天）確保在轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞至少融合60％。如下表所示，在200 μl jetPrime緩沖液中稀釋從步驟37中選擇的gRNA質(zhì)粒和供體質(zhì)粒。充分混合并加入4 μl jetPrime溶液，在室溫下孵育15分鐘，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物添加到細(xì)胞中。在37°C和5％CO 2下孵育4小時(shí)后，將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基替換為正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞，直到它們匯合至?80％

（第3-10天）當(dāng)細(xì)胞達(dá)到約80％匯合時(shí)傳代。 轉(zhuǎn)染后7-10 d對(duì)1–2×107個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選。

Facs選擇表達(dá)熒光標(biāo)簽的單細(xì)胞克隆 10–19 d

關(guān)鍵！單細(xì)胞分選可能會(huì)導(dǎo)致某些細(xì)胞系的生長(zhǎng)問(wèn)題。 因此，重要的是建立最佳的生長(zhǎng)條件，例如通過(guò)使用條件培養(yǎng)基。 條件生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含由親代細(xì)胞系產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子。 條件培養(yǎng)基是一種體積的培養(yǎng)基的混合物，其中親代細(xì)胞系在其中生長(zhǎng)了幾天，另一種體積是新鮮的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。 HeLa Kyoto細(xì)胞在單細(xì)胞分選中存活得比較好，存活率為30–50％。 用至少一個(gè)轉(zhuǎn)染的10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿（如果可能，用1–2×15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每個(gè)含有1-2×107細(xì)胞）進(jìn)行FACS，并將親本細(xì)胞系用作陰性對(duì)照 。

（第1天）準(zhǔn)備五個(gè)用于單細(xì)胞分選的96孔板，每個(gè)孔中添加100 μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

準(zhǔn)備用于FACS單細(xì)胞分選的細(xì)胞。從HeLa Kyoto細(xì)胞的10厘米培養(yǎng)皿中除去生長(zhǎng)培養(yǎng)基。每10厘米培養(yǎng)皿用5–10 ml PBS洗滌細(xì)胞。加入1-2 ml 0.05％的胰蛋白酶-EDTA，在室溫下孵育直到細(xì)胞幾乎從培養(yǎng)皿中分離（1-5分鐘）。除去0.05％的胰蛋白酶-EDTA，并加入2 ml FACS緩沖液。徹底重懸細(xì)胞，并用細(xì)胞過(guò)濾器通過(guò)試管過(guò)濾細(xì)胞。使用HeLa Kyoto細(xì)胞作為FACS的陰性對(duì)照。

對(duì)表達(dá)熒光標(biāo)記的細(xì)胞（通常為mEGFP或mCherry）進(jìn)行單細(xì)胞分選，將其放入含有100 μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基的96孔板中，產(chǎn)生至少五個(gè)含有單細(xì)胞的96孔板。內(nèi)源性標(biāo)記蛋白的熒光信號(hào)通常相對(duì)較暗。陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的效率在陽(yáng)性細(xì)胞的0.05-10％范圍內(nèi)，通常為0.5％。

（第2至12天）讓細(xì)胞克隆在完全生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中于37°C，5％CO2下生長(zhǎng)2至12 d。約5天后檢查細(xì)胞生長(zhǎng)在哪些孔中，單細(xì)胞克隆作為單個(gè)菌落生長(zhǎng)。丟棄含有多細(xì)胞克隆的孔，這些克隆會(huì)在孔的不同區(qū)域以多個(gè)菌落的形式生長(zhǎng)。培養(yǎng)單細(xì)胞克隆，使約50％的孔被細(xì)胞覆蓋。

（第10–12天）要挑選克隆，請(qǐng)去除培養(yǎng)基并用1x PBS沖洗細(xì)胞一次。向每個(gè)孔中添加20μl胰蛋白酶，在室溫下孵育1分鐘，除去胰蛋白酶，添加100μl完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并將所有細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板的新鮮孔中。

（第13天和第14天），如步驟45所述，通過(guò)胰蛋白酶消化將96孔板分開，并準(zhǔn)備DNA復(fù)制品。

讓克隆在96孔板上的37°C，5％CO2的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，直到準(zhǔn)備評(píng)估克隆是否表達(dá)正確標(biāo)記的POI為止。通過(guò)胰酶消化（約80％融合）分裂細(xì)胞

敲入細(xì)胞系的驗(yàn)證。 按照選項(xiàng)A進(jìn)行連接PCR，以驗(yàn)證熒光標(biāo)記已整合到正確的位點(diǎn)并進(jìn)行純合性測(cè)試。 按照選項(xiàng)B進(jìn)行Southern印跡分析，再次顯示純合性并排除標(biāo)簽的脫靶整合。 按照選項(xiàng)C進(jìn)行Sanger測(cè)序，以檢測(cè)基因組位點(diǎn)標(biāo)簽插入位點(diǎn)內(nèi)的突變。 按照選項(xiàng)D進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，以研究隨機(jī)插入標(biāo)簽的表達(dá)。

（a）驗(yàn)證熒光標(biāo)記在正確的位置整合，并通過(guò)連接pcr測(cè)試純合性 1 d（i）設(shè)計(jì)用于連接PCR的寡核苷酸。正向引物在左同源臂外側(cè)5'端，反向引物結(jié)合熒光標(biāo)記基因（表1）。檢測(cè)所有等位基因是否在正確的基因座處標(biāo)記（即它們被純合標(biāo)記），左同源臂外側(cè)5'的正向引物和位于右同源臂外側(cè)3'的反向引物。使用該引物組的兩種PCR產(chǎn)物將指示雜合克?。ㄑa(bǔ)充圖2）。

（ii）關(guān)鍵步驟連接PCR不是定量PCR；因此，有時(shí)無(wú)法檢測(cè)到雜合克隆中的標(biāo)記基因，因?yàn)閮煞NPCR產(chǎn)物之間存在競(jìng)爭(zhēng)（圖4）。如果在檢測(cè)標(biāo)記的基因時(shí)出現(xiàn)問(wèn)題，建議使用用于T7E1分析的引物重復(fù)連接PCR，這將導(dǎo)致PCR產(chǎn)物更短，從而改善兩種PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。但是，使用T7E1引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是引物將位于同源臂內(nèi)，這也會(huì)擴(kuò)增隨機(jī)整合的供體質(zhì)粒。純合標(biāo)記的基因?qū)⒖偸钱a(chǎn)生一種PCR產(chǎn)物。由親代細(xì)胞系（例如HeLa Kyoto細(xì)胞）制備的基因組DNA用于檢測(cè)未標(biāo)記的基因。水控制用于檢測(cè)PCR期間可能發(fā)生的污染。

（iii）-（v）連接PCR的DNA制備。直接從96孔板中除去培養(yǎng)基，加入30 μl DNA裂解緩沖液。 重懸細(xì)胞并將DNA溶液轉(zhuǎn)移到PCR管中。

（vi）將DNA溶液在56°C孵育1小時(shí)，然后在95°C孵育10分鐘。 暫停poInt將DNA儲(chǔ)存在4–8°C，直至進(jìn)一步使用。

（vii）連接PCR。使用HotStar HighFidelity PCR試劑盒擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域，每個(gè)反應(yīng)的設(shè)置如下：

使用以下循環(huán)條件放大目標(biāo)區(qū)域：

（viii）-（xii）跑核酸電泳膠檢測(cè)