前言

肝癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大常見原因，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率排名第六。肝細(xì)胞癌(HCC)占原發(fā)性肝癌的大多數(shù)。雖然近年來HCC的治療取得了很大進(jìn)展，但HCC患者的預(yù)后仍然很差。血管生成對促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。既往研究表明，腫瘤中的血管僅由內(nèi)皮細(xì)胞形成。自上世紀(jì)90年代，許多制藥公司集中精力開發(fā)抑制血管生成的化合物，以“餓死腫瘤細(xì)胞”。一些藥物，如Avastin和Nexavar，已被美國批準(zhǔn)用于癌癥治療。然而，這些藥物只是暫時減緩腫瘤的生長，而且不能完全殺死腫瘤細(xì)胞。此外，許多用這些藥物治療的腫瘤往往產(chǎn)生耐藥性或轉(zhuǎn)移。1999年，Maniotis發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)（Vasculogenic mimicry, VM）。他認(rèn)為，腫瘤中有功能的血供通道可能與內(nèi)皮細(xì)胞無關(guān)，而是由侵襲性腫瘤細(xì)胞形成的。這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤的血液供應(yīng)提供了一個新的視角。到目前為止，VM存在于多種癌癥類型中，如黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)直腸癌、喉部鱗狀細(xì)胞癌、HCC等，并與患者預(yù)后不良有關(guān)。VM是由侵襲性腫瘤細(xì)胞形成的模擬血管生成網(wǎng)絡(luò)，在肝細(xì)胞癌的惡性腫瘤中起重要作用。然而，VM的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的，并沒有完全明確。N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最豐富的可逆甲基化修飾。近年來，許多研究集中在m6a修飾的mRNA的生物學(xué)功能上。m6A修飾被發(fā)現(xiàn)參與多種生物學(xué)過程，并在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。然而，m6A與VM形成之間的關(guān)系尚不清楚。

研究結(jié)果

? 臨床HCC組織中METTL3的表達(dá)與VM及患者預(yù)后不良有關(guān)

作者利用CD34或CD31和periodic acid–Schiff ?(PAS)雙重染色來區(qū)分基質(zhì)VM的形態(tài)模式特征。首先，對75例HCC患者進(jìn)行了回顧性研究。CD31-PAS雙染色和IHC染色后，根據(jù)VM的數(shù)量及METTL3染色強度將病理組分為4個亞組:VM + /METTL3 +，VM?/METTL3 +，VM + /METTL3?和VM?/METTL3?。生存分析顯示，雙陽性組的存活率明顯低于雙陰性組。且METTL3染色強度與VM的數(shù)量也呈正相關(guān)。并對96例HCC患者進(jìn)行了共表達(dá)分析。作責(zé)發(fā)現(xiàn)METTL3與上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與VM標(biāo)志物VE-cadherin、VEGFR1和VEGFR2（補充數(shù)據(jù)），間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin，腫瘤VM微環(huán)境標(biāo)志物，MMP2和MMP9呈正相關(guān)。此外，TCGA數(shù)據(jù)顯示METTL3在364例肝癌患者中的表達(dá)與VM相關(guān)蛋白，CDH5、VIM、FLT1、KDR、MMP2、MMP9、FN1和SERPINE2呈正相關(guān)。另外，根據(jù)METTL3 mRNA表達(dá)情況將患者分為兩組，即：METTL3高表達(dá)組和METTL3低表達(dá)組，兩組之間的差異基因使用GSEA富集尋找METTL3相關(guān)通路。VEGFa信號通路被顯著富集。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3參與了肝細(xì)胞癌VM的形成且與預(yù)后不良密切相關(guān)。

? VM的形成受mRNA的m6A水平的調(diào)控

接下來，進(jìn)一步探究m6A修飾與VM形成的關(guān)系。雖然多種細(xì)胞外配體和微環(huán)境可以誘導(dǎo)VM，但VEGFa被認(rèn)為是HCC細(xì)胞中這一過程的主要誘導(dǎo)物。作者用VEGFa處理3D培養(yǎng)的HepG2和MHCC-97H細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞成管能力明顯提高，并且m6A / mRNA水平顯著上升。同時，利用METTL3的siRNA降低m6A水平后，細(xì)胞成管下降能力，VE-cadherin表達(dá)受抑制，E-cadherin表達(dá)增加；而且，回復(fù)了VEGFa誘導(dǎo)E-cadherin下調(diào)和VE-cadherin上調(diào)。在細(xì)胞中過表達(dá)ALKBH5 (m6A去甲基化酶)后，m6A水平明顯低于對照細(xì)胞，且成管能力較弱。以上數(shù)據(jù)表明，mRNA的m6A水平可能在體外調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌中VM的形成。

??Hippo通路參與m6A依賴性VM的形成

在明確了VM的形成受mRNA的m6A水平的調(diào)控后，作者進(jìn)一步探索其機(jī)制。RNA-seq分析siNC組和siMETTL3組（3D培養(yǎng)后）的轉(zhuǎn)錄組差異，共鑒定出149個差異表達(dá)基因。將這些差異基因與GSE110320中m6A修飾的基因進(jìn)行重疊，我們發(fā)現(xiàn)大部分（75%）差異基因的mRNA被m6A修飾。GO分析重疊基因，在癌癥的惡性發(fā)展中起重要作用的Hippo 信號通路被富集。MeRIP數(shù)據(jù)的分析結(jié)果表明，在YAP1 mRNA中，m6A修飾的豐度較高，特別是在CDS區(qū)域。并且，MeRIP-qPCR結(jié)果顯示，在敲除METTL3細(xì)胞中，YAP1 mRNA的m6A修飾水平顯著降低。

??YAP1在體外通過m6A依賴方式促進(jìn)VM的形成和癌癥進(jìn)展

接下來，作者進(jìn)一步分析YAP1參與VM形成及其與m6A的關(guān)系。首先，通過WB檢測了YAP1的表達(dá)，YAP1在使用siRNA敲降METTL3水平后表達(dá)下調(diào)，在過表達(dá)ALKBH5及VEGFa誘導(dǎo)后上調(diào)。此外，過表達(dá)YAP1可顯著促進(jìn)VM標(biāo)記物VE-cadherin的表達(dá)，降低上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)；下調(diào)METTL3可顯著挽救因YAP1過表達(dá)引起的VE-cadherin水平升高；并且YAP1顯著增加VM的形成及增強細(xì)胞遷移和侵襲，而同時敲降METTL3后，細(xì)胞功能得以恢復(fù)。綜上所述，YAP1在體外通過m6A依賴的方式促進(jìn)VM的形成和腫瘤進(jìn)展。

??m6A提高了YAP1 mRNA的翻譯效率

前面發(fā)現(xiàn)YAP1的表達(dá)受到m6A水平的調(diào)控，那么，m6A修飾如何調(diào)控YAP1的表達(dá)呢？作者隨后進(jìn)一步研究了m6A甲基化調(diào)控YAP1表達(dá)的機(jī)制。敲降METTL3后，檢測YAP1的pre-mRNA和mRNA表達(dá)水平，令人驚訝的是，干擾METTL3后YAP1的轉(zhuǎn)錄水平升高。然后我們用actinomycin-D（放線菌素）對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄阻斷。結(jié)果表明，METTL3干擾后，pre-mRNA和mRNA的半衰期明顯延長。YAP1 mRNA水平與蛋白水平的不同步使作者懷疑m6A修飾可能與YAP1蛋白的翻譯或穩(wěn)定性有關(guān)。接著，用蛋白翻譯抑制劑cycloheximide（環(huán)己酰亞胺）處理METTL3敲低細(xì)胞和相應(yīng)的對照細(xì)胞。WB檢測結(jié)果顯示，兩組實驗蛋白的半衰期無明顯變化。進(jìn)一步采用雙熒光素酶法測定YAP1蛋白的翻譯效率，敲除METTL3后，YAP1蛋白的翻譯效率顯著降低。提示m6A誘導(dǎo)的YAP1表達(dá)與蛋白翻譯的調(diào)控有關(guān)。用蔗糖密度梯度差速離心分離HepG2的總RNA，作者分析核糖體圖譜，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)核糖體翻譯起始復(fù)合物組裝的顯著減少，并且qPCR檢測顯示，siMETTL3細(xì)胞翻譯激活多聚體狀態(tài)下YAP1的mRNA水平明顯降低。綜上所述，m6A主要通過影響翻譯效率來改變YAP1蛋白的表達(dá)。

??沉默METTL3可抑制肝細(xì)胞癌原位移植腫瘤模型中VM的形成和腫瘤進(jìn)展

體外機(jī)制探明后，作者接著采用原位肝癌移植腫瘤模型，研究m6A甲基化在肝癌轉(zhuǎn)移和體內(nèi)VM形成過程中的潛在影響。首先，將表達(dá)有sh-contorl和sh-METTL3 的SK-Hep1-Luc 細(xì)胞注射到裸鼠肝臟中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在shMETTL3組，裸鼠全身和肺組織的熒光素酶信號受到抑制；Kaplan-Meier生存分析顯示sh-METTL3裸鼠預(yù)后良好。并且，裸鼠shMETTL3的腫瘤病灶和VM計數(shù)顯著低于對照小鼠。免疫組化染色分析顯示在shMETTL3組，VM標(biāo)記物VE-cadherin和其他參與VM 的蛋白MMP2，MMP9，F(xiàn)ibronectin的表達(dá)水平下降，同時，YAP1的表達(dá)也被抑制，而E-cadherin表達(dá)上升。綜上所述，m6A甲基化在體內(nèi)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和VM的形成。

??m6A依賴性的YAP1表達(dá)在DEN誘導(dǎo)的Mettl3+/?肝癌小鼠模型中促進(jìn)VM形成和腫瘤轉(zhuǎn)移

為了進(jìn)一步研究m6A和YAP1在體內(nèi)癌癥進(jìn)展和VM形成中的作用，作者使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了Mettl3+/?C57BL6/J小鼠（敲除METTL3對胚胎是致命的，敲除了一個等位基因），可以發(fā)現(xiàn)，METTL3在小鼠肝組織中顯著下調(diào)。隨后，作者使用DEN（二乙基亞硝胺）處理小鼠，誘導(dǎo)HCC模型。造模成功后，一半的Mettl3+/?小鼠接受了治療，將YAP1質(zhì)粒注射入尾靜脈即Mettl3+/?+ YAP1組，另一半Mettl3+/?小鼠用對照質(zhì)粒，Mettl3+/?+Vector組，野生型老鼠用對照質(zhì)粒，Wt + Vector組。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mettl3+/?+Vector組小鼠腫瘤病灶明顯少于Wt +Vector組，而接受YAP1質(zhì)粒注射后，減少的腫瘤病灶明顯恢復(fù)。肺轉(zhuǎn)移病灶及VM檢測結(jié)果與此類似，相比于Wt +Vector組，Mettl3+/?+Vector組肺轉(zhuǎn)移病灶及VM數(shù)量明顯減少，而在接受YAP1質(zhì)粒注射后，被恢復(fù)。免疫組化染色分析顯示VE-cadherin，MMP2和MMP9的表達(dá)在Mettl3+/?+Vector小鼠中下降，而過表達(dá)YAP1挽救了敲除METTL3的影響。這些數(shù)據(jù)表明，在DEN誘導(dǎo)的Mettl3+/?肝癌小鼠模型中，敲除METTL3可以減弱其對癌癥進(jìn)展及VM形成的影響，而YAP1恢復(fù)了敲除METTL3的影響。

總結(jié)

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)m6A 甲基化酶 METTL3在HCC組織中的表達(dá)與VM呈正相關(guān)。VEGFa處理的3D培養(yǎng)細(xì)胞中m6A mRNA水平升高，與VM的形成及VM相關(guān)的標(biāo)記物有關(guān)。RNA測序和功能研究表明Hippo通路參與了m6A介導(dǎo)的VM形成。m6A修飾可以促進(jìn)YAP1 mRNA的翻譯，激活Hippo通路。此外，m6A依賴的YAP1表達(dá)在體內(nèi)外均可促進(jìn)VM的形成、遷移、侵襲。作者研究結(jié)果表明，m6A修飾在HCC中VM的形成中起關(guān)鍵作用。METTL3和YAP1可能通過阻礙VM的形成成為抗轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。