基因表達(dá)失調(diào)幾乎與所有人類疾病相關(guān)，而表觀遺傳修飾可以介導(dǎo)這一過程。表觀遺傳編輯旨在通過重寫表觀遺傳標(biāo)記來重新編程基因表達(dá)，而無需編輯基因組。表觀遺傳編輯的概念誕生于十多年前，最初在療效和特異性方面面臨著諸多挑戰(zhàn)。此外，如何針對(duì)特定基因誘導(dǎo)持續(xù)表達(dá)調(diào)控的明確指導(dǎo)原則仍然十分缺乏。然而，在多種疾病的動(dòng)物模型中，表觀遺傳編輯已取得一定成功，并且首批臨床試驗(yàn)也已啟動(dòng)。對(duì)表觀遺傳重編程機(jī)制的深入理解正在克服最初阻礙表觀遺傳編輯廣泛應(yīng)用的障礙。未來在靶向特異性、重編程維持和遞送方法方面的進(jìn)展將使表觀遺傳編輯成為一種強(qiáng)有力的新型治療方法。
短短十年間，表觀遺傳編輯（即靶向基因的表觀遺傳修飾重寫）領(lǐng)域已從概念驗(yàn)證發(fā)展到臨床研究。這一進(jìn)展得益于大規(guī)模的多組學(xué)研究，這些研究揭示了許多疾病與基因表達(dá)的整體變化以及DNA上的表觀遺傳修飾（例如胞嘧啶甲基化）及其相關(guān)的組蛋白（圖1a）密切相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了表觀遺傳修飾酶（如寫入酶、擦除酶、讀取酶或重塑酶）小分子抑制劑的商業(yè)化開發(fā)（圖1b）。目前，已有十種表觀遺傳藥物獲得FDA批準(zhǔn)（見表1），其中九種用于腫瘤治療，最近一種用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥，還有更多藥物正在研發(fā)中。然而，盡管這些藥物主要對(duì)某些血液系統(tǒng)惡性腫瘤有效，但它們的作用范圍廣且短暫，并伴有毒性，限制了其廣泛的臨床應(yīng)用。對(duì)特定基因組位點(diǎn)的表觀遺傳修飾進(jìn)行控制編輯，提供了一種替代方法，可以穩(wěn)定地重編程靶基因表達(dá)，而不會(huì)影響整個(gè)表觀基因組，也不會(huì)改變DNA序列。
盡管通過在真核細(xì)胞中招募催化表觀遺傳效應(yīng)因子來改變特定內(nèi)源基因組位點(diǎn)的表觀遺傳修飾這一概念（圖1c，左）早在2003年就被報(bào)道用于組蛋白修飾和DNA甲基化，但在接下來的十年里，它卻相對(duì)被忽視。十年后，當(dāng)這種方法被命名為表觀遺傳編輯時(shí)，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編輯內(nèi)源位點(diǎn)的特定表觀遺傳修飾以調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，而表觀遺傳編輯在治療乃至治愈疾病方面的巨大潛力卻鮮為人知。CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)，作為一種廉價(jià)、靈活且特異性強(qiáng)的基因靶向工具，極大地推動(dòng)了表觀遺傳編輯研究的快速增長。事實(shí)上，過去十年見證了學(xué)術(shù)界和商業(yè)界對(duì)表觀遺傳編輯的大量投資，將其視為一種研究工具和治療策略。最近在小鼠和猴子模型中通過表觀遺傳編輯實(shí)現(xiàn)持久有效的治療性基因沉默的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（與CRISPR基因敲除相當(dāng)）引發(fā)了人們對(duì)這項(xiàng)技術(shù)的更大興趣。
表觀遺傳編輯公司如今已成為生物技術(shù)和制藥行業(yè)的重要參與者（表2），致力于利用表觀遺傳編輯技術(shù)開發(fā)針對(duì)多種疾?。ɡ绨┌Y、神經(jīng)退行性疾病和遺傳性疾?。┑膭?chuàng)新療法。事實(shí)上，首個(gè)表觀遺傳編輯工具OTX?2002（Omega Therapeutics 公司）的臨床試驗(yàn)已于2022年啟動(dòng)。OTX?2002是一種由脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）遞送的mRNA編碼的表觀遺傳修飾劑，旨在降低肝細(xì)胞癌和其他MYC相關(guān)實(shí)體瘤中MYC癌基因的表達(dá)。最近，Tune Therapeutics在新西蘭和香港啟動(dòng)了臨床試驗(yàn)，測(cè)試一種表觀遺傳沉默劑治療慢性乙型肝炎和丁型肝炎；Epicrispr在美國和新西蘭啟動(dòng)了一項(xiàng)試驗(yàn)，用于治療面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥(FSHD)（表2）。
盡管表觀遺傳編輯作為一種臨床策略前景廣闊，但謹(jǐn)慎行事是必要的。目前，表觀遺傳編輯作為一種治療手段的發(fā)展速度超過了我們對(duì)表觀遺傳調(diào)控的認(rèn)知，這可能導(dǎo)致在早期臨床試驗(yàn)中測(cè)試的藥物并非最佳選擇。事實(shí)上，實(shí)現(xiàn)簡便、有效、持久且可逆的表觀遺傳編輯的規(guī)則和工具在很大程度上仍不為人知，而且很可能取決于具體情況。此外，表觀遺傳編輯的安全臨床轉(zhuǎn)化將面臨與DNA編輯技術(shù)類似的挑戰(zhàn)，尤其是在遞送方面。
本綜述旨在對(duì)表觀遺傳編輯的潛力和不足進(jìn)行平衡的探討。首先，本文回顧了具有里程碑意義的研究，這些研究證明了表觀遺傳編輯的潛力，并克服了最初認(rèn)為的局限性。鑒于表觀遺傳編輯的快速臨床轉(zhuǎn)化，解決這些先前的障礙提供了值得認(rèn)真考慮的深刻見解。接下來，本文回顧了體內(nèi)表觀遺傳編輯研究，這些研究表明，將表觀遺傳修飾酶和/或擦除酶靶向目標(biāo)基因有望成為治療多種疾病的臨床方法。本文特別關(guān)注遞送問題，這是表觀遺傳編輯臨床開發(fā)的主要挑戰(zhàn)之一。學(xué)術(shù)界和商業(yè)界對(duì)DNA編輯方法的大量投資有望解決至少部分技術(shù)遞送難題。如果能夠獲得足夠的時(shí)間和資源來從臨床結(jié)果中吸取經(jīng)驗(yàn)，這些編輯研究將為表觀遺傳編輯成為臨床領(lǐng)域的新興力量鋪平道路。
表觀遺傳編輯工具
人體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞的遺傳信息總體上保持穩(wěn)定，但不同類型的細(xì)胞卻具有不同的細(xì)胞程序、形態(tài)和功能。這種顯著的能力是通過表觀遺傳機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，其中包括對(duì)DNA分子和組蛋白的調(diào)控性化學(xué)修飾。這些機(jī)制共同構(gòu)成表觀基因組，并以有絲分裂穩(wěn)定的方式調(diào)節(jié)核小體定位、染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)。
胞嘧啶DNA甲基化（5mC）是基因組中胞嘧啶結(jié)構(gòu)單元的一種共價(jià)化學(xué)修飾，其位置會(huì)影響基因表達(dá)，從而調(diào)控分化程序。5mC的失調(diào)可能導(dǎo)致功能障礙，因此已被廣泛研究作為疾病診斷的生物標(biāo)志物。另一方面，組蛋白的翻譯后修飾也會(huì)影響基因表達(dá)。例如，組蛋白乙?；梢阅技瘏⑴c轉(zhuǎn)錄起始和染色質(zhì)重塑的含溴結(jié)構(gòu)域蛋白。盡管技術(shù)難度更高，但差異性組蛋白修飾已被研究作為疾病的生物標(biāo)志物。為了驗(yàn)證失調(diào)基因作為治療靶點(diǎn)的有效性，人們開展了包括基因靶向策略在內(nèi)的各種研究，以探究基因在其相關(guān)背景下的功能。由于表觀遺傳失調(diào)經(jīng)常與疾病相關(guān)，因此恢復(fù)或修改基因表達(dá)譜的表觀遺傳干預(yù)措施在臨床應(yīng)用中具有重要前景。
表觀遺傳編輯可以通過寫入活性修飾來驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，這些修飾可以募集轉(zhuǎn)錄機(jī)制或增加染色質(zhì)可及性（圖1d），或者通過消除抑制性修飾來驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。表觀遺傳編輯通過寫入抑制性修飾來沉默基因表達(dá)，其機(jī)制包括直接阻斷轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其靶DNA序列的識(shí)別，或促進(jìn)染色質(zhì)壓縮以限制轉(zhuǎn)錄因子的募集（圖1e）。此外，表觀遺傳編輯還可能驅(qū)動(dòng)表觀基因組的二次改變，這些改變協(xié)同作用，最終實(shí)現(xiàn)基因的強(qiáng)效激活或沉默。例如，靶向募集活性組蛋白乙?；脸蜃涌梢阅技瘍?nèi)源性抑制性組蛋白甲基化寫入因子。目前已有大量表觀遺傳寫入因子和擦除因子被研究，極大地增進(jìn)了我們對(duì)基因調(diào)控表觀遺傳機(jī)制的理解。
表觀遺傳編輯器
表觀遺傳編輯可以定義為針對(duì)特定基因位點(diǎn)的表觀遺傳修飾的覆蓋，從而改變基因組位點(diǎn)的功能。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，理想的表觀遺傳編輯器應(yīng)包含一個(gè)小型、無免疫原性、易于編程的基因特異性DNA結(jié)合域（DNA binding domain，DBD），該DBD與表觀遺傳效應(yīng)域或多個(gè)表觀遺傳效應(yīng)域融合，從而能夠僅在靶位點(diǎn)直接寫入或擦除表觀遺傳修飾。因此，表觀遺傳編輯能夠?qū)⒈碛^遺傳標(biāo)記重寫為顯性或隱性的修飾，永久性地重編程染色質(zhì)功能（例如基因表達(dá)），同時(shí)保留可逆性。本綜述重點(diǎn)關(guān)注直接的酶促作用機(jī)制（指的是利用催化效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（表觀遺傳寫入器或擦除器）直接寫入或重寫表觀遺傳修飾（圖1c，左圖），這些結(jié)構(gòu)域與靶向特定DNA序列的可編程DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合），而非同樣前景廣闊的基因靶向表達(dá)調(diào)控方法，后者并不直接重寫表觀遺傳修飾。人工轉(zhuǎn)錄因子（Artificial transcription factors，ATFs）是一類重要的間接表觀遺傳編輯工具，本文也描述了從其發(fā)展中獲得的一些見解，因?yàn)檫@有助于優(yōu)化直接表觀遺傳編輯工具。結(jié)合高效且細(xì)胞特異性的遞送方法，表觀遺傳編輯有望成為一種多功能工具，用于糾正多種病理生理現(xiàn)象。
直接表觀遺傳編輯
本綜述使用“直接表觀遺傳編輯 (direct epigenetic editing)”一詞，指的是：使用催化效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（表觀遺傳寫入器或擦除器）直接寫入或重寫表觀遺傳修飾（圖 1c，左圖）并與可編程DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD，見方框 2）融合，該結(jié)構(gòu)域靶向特定的DNA序列。這一嚴(yán)格的定義使本文重點(diǎn)關(guān)注報(bào)告基因組位點(diǎn)直接表觀遺傳覆蓋效應(yīng)和維持的研究。因此，對(duì)體內(nèi)研究的全面總結(jié)（表 3）排除了不靶向特定位點(diǎn)的編輯方法，例如那些使用內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子DBD或表觀遺傳讀取蛋白在基因組的多個(gè)位置募集催化結(jié)構(gòu)域的方法。此外，該定義排除了間接表觀遺傳效應(yīng)因子（圖1c，右圖），包括人工轉(zhuǎn)錄因子（ATFs），它們可以通過募集表觀遺傳酶間接改變基因位點(diǎn)的表觀遺傳特征（見方框3）。盡管本文重點(diǎn)關(guān)注直接表觀遺傳編輯，但也重點(diǎn)介紹了一些使用間接表觀遺傳效應(yīng)因子的開創(chuàng)性研究，這些研究為直接表觀遺傳編輯提供了重要的見解，并體現(xiàn)了臨床領(lǐng)域的重要進(jìn)展。
可編程DNA結(jié)合域。最初人們探索了多種類型的可編程DBD，包括合成聚酰胺和三鏈形成寡核苷酸，但這些方法被證明難以廣泛應(yīng)用。在CRISPR技術(shù)問世之前，工程化鋅指蛋白（zinc finger proteins，ZFPs）和植物病原體衍生的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白（transcription?activator-like effectors，TALEs）主導(dǎo)了可編程DBD領(lǐng)域（方框2）。基于真核生物中最豐富的轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計(jì)的ZFP體積較?。s含30個(gè)氨基酸，每個(gè)結(jié)合3?4個(gè)堿基對(duì)的鋅指），尤其與CRISPR?Cas9（約含1000?1400個(gè)氨基酸，靶向20個(gè)核苷酸）相比，其體積更小，通常由3?6個(gè)模塊化的工程化鋅指陣列組成。TALEs也相對(duì)較?。總€(gè)TAL重復(fù)序列約含33?35個(gè)氨基酸），一個(gè)重復(fù)序列可與靶DNA中的一個(gè)堿基對(duì)結(jié)合。ZFPs和TALEs都需要對(duì)每個(gè)重復(fù)序列進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造才能實(shí)現(xiàn)基因靶向。與ZFPs和TALEs相比，CRISPR?Cas9平臺(tái)的相對(duì)簡便性和低成本徹底革新了靶向基因組編輯（方框2）。CRISPR?Cas9問世后不久，其核酸酶失活版本（dCas9）被報(bào)道，使得表觀遺傳編輯得以廣泛應(yīng)用于眾多科學(xué)領(lǐng)域的研究人員。
可編程DNA結(jié)合域 (ZFPS、TALES、CRISPR)
早期的可編程DNA結(jié)合域(鋅指蛋白(ZFPS)和轉(zhuǎn)錄激活因子類似效應(yīng)物(TALEs)) 最初被用于通過將這些蛋白與核酸酶融合來誘導(dǎo)雙鏈斷裂。盡管目前這些技術(shù)已被更具靈活性的CRISPR平臺(tái)所取代，但 ZFPs和TALEs仍被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究中，并且正不斷得到進(jìn)一步發(fā)展。這歸因于其較小的尺寸、較低的免疫原性以及DNA結(jié)合方式 (保持雙鏈結(jié)構(gòu)完整。ZF核酸酶與TALE核酸酶融合體 (ZFNs/TALENs) 被用于針對(duì)特定位點(diǎn)的基因組編輯的基礎(chǔ)性研究，并為靶向其他效應(yīng)物域奠定了基礎(chǔ)。CRISPR的引入極大地促進(jìn)了基因組編輯，因?yàn)樗哂泄逃械暮怂崦富钚院秃唵蔚牡统杀局鼐幊?。CRISPR-Cas9 核酸酶使用RNA引導(dǎo)的DNA靶向，這依賴于核苷酸同源堿基配對(duì)，并避免了為每個(gè)靶DNA設(shè)計(jì)新的ZFP或TALE蛋白的需要。CRISPR基因組編輯已經(jīng)發(fā)現(xiàn)28個(gè)臨床成功，例如，在治療白血病和失明重要的是，第一個(gè)CRISPR藥物 (Casgevy)最近在英國和美國獲得批準(zhǔn)，用于治療鐮狀細(xì)胞病和地中海貧血。 然而，基因組編輯療法的進(jìn)一步發(fā)展必須受到嚴(yán)密監(jiān)控，以避免過早出現(xiàn)可能阻礙該領(lǐng)域發(fā)展的失敗情況，正如21世紀(jì)初的基因療法所經(jīng)歷的那樣。例如，毒性已導(dǎo)致部分參與試驗(yàn)的患者死亡，而對(duì)免疫反應(yīng)和DNA損傷的長期影響尚有待評(píng)估?；蚪M編輯最具不可預(yù)測(cè)性的毒性在于因雙鏈斷裂而導(dǎo)致大片段染色體的丟失，但也不能排除對(duì)宿主DNA序列的其他意外改變。為了克服這些局限性，CRISPR-Cas9核酸酶已被進(jìn)行突變，以阻止雙鏈斷裂的引入，而僅對(duì)DNA的一側(cè)進(jìn)行切割。將Cas9切割酶與堿基編輯和prime編輯效應(yīng)物融合，為無雙鏈斷裂的基因組編輯提供了強(qiáng)有力的替代方案。盡管取得了這一進(jìn)展，但遺傳毒性問題仍無法排除，因?yàn)镈NA切割仍會(huì)激活DNA修復(fù)途徑。除了對(duì)患者造成的毒性影響外，還存在與靶標(biāo)和非靶標(biāo)基因組工程的可遺傳性相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，用于表觀遺傳學(xué)編輯的經(jīng)核酶滅活后的CRISPR-dCas9系統(tǒng)，或許能為臨床應(yīng)用領(lǐng)域提供一種更為安全的替代方案。
能夠調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)結(jié)構(gòu)域和其他間接表觀遺傳編輯因子。人工轉(zhuǎn)錄因子（框3）由DBD與全長蛋白質(zhì)（或結(jié)構(gòu)域）融合而成，它們?cè)诓恢苯泳庉嫳碛^遺傳修飾的情況下調(diào)節(jié)基因表達(dá)（圖1c，右）。研究最為廣泛的是源自病毒或人類轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子。許多轉(zhuǎn)錄激活因子已被驗(yàn)證，包括病毒VP16四聚體VP64、病毒RTA48以及來自人類轉(zhuǎn)錄因子p65或NCOA3、FOXO3和ZNF473的結(jié)構(gòu)域。轉(zhuǎn)錄抑制因子包括來自ZNF10、ZIM3或ZNF705等的KRAB結(jié)構(gòu)域。這些ATFs的募集可通過內(nèi)源性表觀遺傳機(jī)制的二次募集間接導(dǎo)致表觀遺傳修飾，但這些效應(yīng)難以預(yù)測(cè)，且大多數(shù)ATFs的作用通常是短暫的。例如，在小鼠模型中，沉默與Angelman綜合征相關(guān)的反義轉(zhuǎn)錄本需要重復(fù)遞送ZF-KRAB才能實(shí)現(xiàn)長期抑制。類似地，ATFs短暫表達(dá)后對(duì)靶基因激活的影響會(huì)隨時(shí)間推移而減弱。因此，持久的基因調(diào)控需要ATFs的長期表達(dá)，這通常通過使用整合到宿主基因組中的慢病毒或腺相關(guān)病毒（AAVs）來實(shí)現(xiàn)，AAVs以游離體形式維持，僅在細(xì)胞分裂時(shí)才會(huì)被稀釋。在這方面，單次遞送AAVs表達(dá)ZF-KRAB足以持久地挽救Angelman綜合征小鼠模型的行為表型。然而，ATFs的持續(xù)表達(dá)掩蓋了穩(wěn)定靶基因調(diào)控的間接機(jī)制，包括染色質(zhì)的變化。
人工轉(zhuǎn)錄因子(間接表觀遺傳編輯)
為了利用基因靶向技術(shù)，同時(shí)不對(duì)基因序列進(jìn)行任何改動(dòng)，已將轉(zhuǎn)錄激活劑或阻遏劑與可編程的DNA結(jié)合域融合在一起。這種人工轉(zhuǎn)錄因子 (ATFs) 具有“喚醒沉睡基因”以及“抑制尖叫基因”的潛力。這與編輯基因序列的方式截然不同，后者會(huì)永久性地改變基因組，通常會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)完全消失，或者與CDNA基因療法相反，旨在(過度)表達(dá)外源基因。盡管目前仍使用并優(yōu)化RNA靶向方法，如小干擾RNA(SiRNA)和反義寡核苷酸(ASOs)等，但ATFs相較于這些方法具有優(yōu)勢(shì)，包括能夠以相同技術(shù)實(shí)現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)作用，能夠臨時(shí)性地從內(nèi)源位點(diǎn)調(diào)控單個(gè)轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體，能夠進(jìn)行部分敲低或更生理性的上調(diào)(而非過度表達(dá))以調(diào)節(jié)干預(yù)效果。
二十年前，SangamoBiosciences啟動(dòng)了首個(gè)ATF臨床試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄激活劑ZF-p65被靶向VEGFA并施用于糖尿病患者，以誘導(dǎo)血管生成并減少神經(jīng)病變。到2008年，該構(gòu)造已在第II期臨床試驗(yàn)中得到測(cè)試(糖尿病神經(jīng)病變、干細(xì)胞動(dòng)員、肌萎縮側(cè)索硬化癥)。盡管VEGFA-ZF-D65在患者中耐受良好，但與接受安慰劑治療的糖尿病患者相比，其治療效益有限，而安慰劑患者的表現(xiàn)優(yōu)于接受常規(guī)醫(yī)療的患者。進(jìn)一步的臨床研究工作隨即被叫停，而研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向了鋅指核酸酶(ZFNs)。?
由于CRISPR平臺(tái)的多功能性，人們對(duì)將CRISPR用于基因表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生了廣泛的興趣。通過使用組合式單向?qū)NAs (sgRNAs)和效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，以及新型效應(yīng)蛋白募集方式，CRISPR的效率得到了進(jìn)一步提高。dCas9與多個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合可以增強(qiáng)靶基因的激活，例如dCas9-VPR（VP64、p65 和 RTA）、協(xié)同激活介質(zhì) (SAM；MCP-p65-HSF1) 或 NFZ（NCOA3、FOXO3、ZNF473）。其他平臺(tái)包括 dCas9-親和標(biāo)簽融合蛋白（可募集抗體-效應(yīng)蛋白融合蛋白，如SunTag、SSSavi）和 sgRNA-MS2 莖環(huán)融合蛋白（可募集莖環(huán)結(jié)合蛋白-效應(yīng)蛋白融合蛋白）。高通量篩選最近發(fā)現(xiàn)了一些結(jié)構(gòu)更緊湊、效力更強(qiáng)的候選轉(zhuǎn)錄效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（40-85個(gè)氨基酸），這些結(jié)構(gòu)域在多個(gè)基因位點(diǎn)高效發(fā)揮作用，并有望改善ATFs在轉(zhuǎn)化應(yīng)用中的遞送效率。ATFs在開拓體內(nèi)治療相關(guān)性以及展示等位基因特異性、多重和雙向基因調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用。?
激活A(yù)TFs在體內(nèi)的有效性已在針對(duì)多種病理狀況的研究中得到證實(shí)。例如，dCas9-SAM誘導(dǎo)的Oct4激活改善了衰老的特征表現(xiàn)，而ZF-VP64激活Psd95足以在衰老及阿爾茨海默病小鼠模型中挽救記憶功能。激活A(yù)TFs也可能被證明在治療神經(jīng)發(fā)育性疾病(如德拉韋特綜合征)方面具有療效。針對(duì)此類疾病，基于ZF-VP64的AAV臨床試驗(yàn)已啟動(dòng)，其依據(jù)是小鼠和非人靈長類動(dòng)物研究中取得的積極成果。利用ZF-KRAB或dCas9-KRAB ATFs進(jìn)行靶向基因抑制顯示出在代謝學(xué)、神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)發(fā)育障礙等領(lǐng)域中的翻譯潛力，同時(shí)還有助于提升嵌合抗原受體(CAR)-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。
其他能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的間接表觀遺傳編輯因子包括染色質(zhì)讀取因子，例如HP1和MeCP2，以及染色質(zhì)重塑因子，例如BAF（圖1b）。間接表觀遺傳編輯也可通過將DBD與未修飾的組蛋白H3尾部（H3K4me0）的一部分融合來實(shí)現(xiàn)（稱為用于甲基轉(zhuǎn)移酶自身抑制釋放的偶聯(lián)組蛋白尾部(CHARM)），該融合物可募集內(nèi)源性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A (DNMT3A)，從而在分裂細(xì)胞中以KRAB介導(dǎo)的沉默增強(qiáng)表觀遺傳記憶。盡管在體內(nèi)非分裂腦細(xì)胞中，維持DNA甲基化誘導(dǎo)的沉默并不需要KRAB，但這種KRAB?DNMT3A3L組合通常用于后續(xù)詳述的“即擊即走（hit-and-run）”治療。值得注意的是，使用KRAB和MeCP2的間接表觀遺傳編輯表明，無需DNA甲基化即可實(shí)現(xiàn)沉默的維持。事實(shí)上，僅將KRAB靶向整合的報(bào)告基因即可通過募集內(nèi)源效應(yīng)因子（KAP1和SETDB1，后者負(fù)責(zé)H3K9me3的寫入）促進(jìn)異染色質(zhì)形成，從而導(dǎo)致穩(wěn)定的基因沉默。延長KRAB募集時(shí)間或增加募集到靶位點(diǎn)的KRAB效應(yīng)因子數(shù)量，均可增大H3K9me3異染色質(zhì)區(qū)域的大小，最終導(dǎo)致更多的DNA甲基化（由于H3K9me3與DNA甲基化之間的內(nèi)源性反饋）和增強(qiáng)表觀遺傳記憶。類似地，激活結(jié)構(gòu)域與SS18（BAF的一部分）的組合也顯示出間接誘導(dǎo)長期表觀遺傳改變的潛力。
直接表觀遺傳編輯因子。目前已發(fā)現(xiàn)許多能夠?qū)懭牖虿脸碛^遺傳修飾的酶。對(duì)于大多數(shù)酶而言，其確切的（依賴于特定環(huán)境的）功能尚不清楚，而將其靶向基因組位點(diǎn)有助于揭示其作用機(jī)制。目前，已驗(yàn)證的直接催化表觀遺傳效應(yīng)因子有多種，包括DNMT3A和DNMT3B、四甲基胞嘧啶雙加氧酶（TETs）、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300、組蛋白賴氨酸N?甲基轉(zhuǎn)移酶G9A、組蛋白去乙?；?（HDAC3）和賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）。由于表觀遺傳編輯酶能夠在不改變DNA序列的情況下對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行長期調(diào)控，因此這些工具可能比不可逆的基因組編輯策略更加安全。
迄今為止，間接和直接催化表觀遺傳編輯劑的組合已成為有效且持續(xù)調(diào)控基因表達(dá)的最直接方法。最近的體內(nèi)研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，該研究將DNA甲基化（由DNMT3A介導(dǎo)）與KRAB對(duì)組蛋白修飾的間接作用相結(jié)合，從而導(dǎo)致長期沉默，盡管在某些情況下，DNA甲基化本身可能就足夠了（另見方框4）。類似地，盡管僅通過靶向TET即可實(shí)現(xiàn)人工沉默基因的穩(wěn)定重新表達(dá)，但持續(xù)激活天然沉默的基因可能也需要效應(yīng)因子的組合。最近，高通量方法在酵母和人類細(xì)胞中測(cè)試了數(shù)千種組合構(gòu)建體，發(fā)現(xiàn)了用于表觀遺傳沉默和激活記憶的新型組合。接下來將全面概述直接表觀遺傳編輯的發(fā)展歷程，從具有洞察力的染色質(zhì)生物學(xué)研究工具到一類具有廣泛臨床應(yīng)用前景的新型靈活療法。
高效、安全的直接表觀遺傳編輯的考量
當(dāng)“表觀遺傳編輯”這一術(shù)語首次提出時(shí)，表觀遺傳學(xué)作為一門獨(dú)立學(xué)科仍在發(fā)展之中，當(dāng)時(shí)人們普遍認(rèn)為表觀遺傳編輯的臨床應(yīng)用并不現(xiàn)實(shí)。最初的擔(dān)憂主要集中在以下幾個(gè)方面：首先，直接表觀遺傳編輯能否充分有效地寫入或擦除表觀遺傳標(biāo)記，從而調(diào)控內(nèi)源基因表達(dá)；其次，臨床應(yīng)用所需的位點(diǎn)特異性；第三，表觀遺傳沉默基因能否被表觀遺傳編輯工具觸及，因?yàn)檫@些基因緊密地排列在“封閉”的異染色質(zhì)中；第四，誘導(dǎo)的表觀遺傳重編程的穩(wěn)定性（圖2）。這些潛在的缺陷限制了表觀遺傳編輯的早期應(yīng)用，只有少數(shù)先驅(qū)實(shí)驗(yàn)室開展了相關(guān)研究。下文將回顧一些針對(duì)直接表觀遺傳編輯局限性的關(guān)鍵研究，并以間接表觀遺傳編輯為例，重點(diǎn)介紹一些重要的進(jìn)展。
充分性和有效性
數(shù)十年的研究已證實(shí)，表觀基因組的變化與基因表達(dá)的變化密切相關(guān)。為了驗(yàn)證因果關(guān)系，通過直接表觀遺傳編輯強(qiáng)制寫入或擦除表觀遺傳標(biāo)記是一種強(qiáng)有力的手段。在大多數(shù)情況下，靶向編輯染色質(zhì)修飾確實(shí)足以改變基因表達(dá)。然而，目前尚無法預(yù)測(cè)在特定細(xì)胞類型中，對(duì)靶位點(diǎn)上的單個(gè)表觀遺傳修飾進(jìn)行表觀遺傳編輯是否足以調(diào)控靶基因的表達(dá)（圖2a）。這種困惑源于我們對(duì)轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)之間機(jī)制聯(lián)系的了解有限，以及人類基因調(diào)控?絡(luò)的復(fù)雜性。在人類細(xì)胞中，存在約1600個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和約900個(gè)染色質(zhì)調(diào)控因子，轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)調(diào)控之間存在廣泛的相互作用。此外，不同細(xì)胞類型表達(dá)不同的轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子亞群，從而影響表觀遺傳編輯的可能結(jié)果。
因果關(guān)系。理解表觀遺傳機(jī)制的一個(gè)重要考量是，特定的表觀遺傳修飾是基因表達(dá)的原因還是結(jié)果。例如，RNA聚合酶II的降解既會(huì)抑制轉(zhuǎn)錄，也會(huì)消耗活性組蛋白修飾；而Yamanaka轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞分化會(huì)在基因表達(dá)改變之前引起表觀遺傳改變。H3K27乙?；℉3K27ac）的研究凸顯了每種表觀遺傳修飾功能尚不明確，H3K27乙?；ǔＥc活躍的基因表達(dá)相關(guān)。盡管研究發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)賴氨酸殘基（包括H3K27）上進(jìn)行乙酰化的表觀遺傳編輯足以激活基因表達(dá)，但全基因組整合H3K27ac缺陷突變體破壞了Polycomb誘導(dǎo)的基因抑制（由H3K27me3介導(dǎo)），但對(duì)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄沒有影響。另一種激活標(biāo)記（H3K4me3）的作用可能是在轉(zhuǎn)錄延伸過程中釋放停滯的RNA聚合酶II，而不是啟動(dòng)基因表達(dá)，這解釋了為什么K4me3的寫入并不總是足以誘導(dǎo)基因表達(dá)。這些研究以及其他研究表明，將單個(gè)表觀遺傳修飾與基因表達(dá)聯(lián)系起來的機(jī)制仍在被解析；直接的表觀遺傳編輯有助于揭開這些機(jī)制的奧秘。
表觀遺傳修飾因子有效性的首個(gè)證據(jù)來源于對(duì)合成報(bào)告基因構(gòu)建體的靶向研究。盡管此類構(gòu)建體具有指導(dǎo)意義，但由于可能與轉(zhuǎn)基因沉默存在協(xié)同作用，它們可能比內(nèi)源基因位點(diǎn)更容易被沉默。2003年，靶向VEGFA啟動(dòng)子的ZF?G9a和ZF?Suv39H1率先實(shí)現(xiàn)了表觀遺傳編輯以沉默內(nèi)源基因，從而富集了抑制性組蛋白修飾H3K9me3。直到十年后，ZF-G9a調(diào)控Her2/Neu18、TALE-LSD1調(diào)控增強(qiáng)子以及光激活TALEs調(diào)控Neurog2和Grm2的針對(duì)性研究才重現(xiàn)了通過表觀遺傳編輯抑制哺乳動(dòng)物內(nèi)源基因的現(xiàn)象。通過表觀遺傳編輯激活內(nèi)源基因是通過寫入活性修飾實(shí)現(xiàn)的，例如p300或CBP100介導(dǎo)的組蛋白乙酰化，或PRDM9介導(dǎo)的H3K4位點(diǎn)組蛋白甲基化。
除了組蛋白之外，DNA修飾的表觀遺傳編輯也被證明足以抑制或激活內(nèi)源基因表達(dá)。利用ZF?DNMT3A和與DNMT3L聯(lián)合使用（ZF?DNMT3A3L）首次證實(shí)了通過DNA甲基化修飾進(jìn)行表觀遺傳編輯并抑制內(nèi)源基因表達(dá)。靶向DNA去甲基化和相關(guān)的基因激活是通過募集TET1或TET1/2/3實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，這些早期研究表明，在內(nèi)源基因處寫入或擦除DNA甲基化確實(shí)可以指導(dǎo)基因表達(dá)的改變。這些早期的DNA甲基化編輯研究很快得到了大量的后續(xù)研究?？傊瑢?duì)內(nèi)源基因的研究證實(shí)，DNA和組蛋白修飾的表觀遺傳編輯可以因果性地調(diào)控基因表達(dá)。
環(huán)境依賴性。盡管在許多情況下表觀遺傳編輯足以發(fā)揮作用，但研究發(fā)現(xiàn)，其有效性取決于靶位點(diǎn)、表觀遺傳效應(yīng)因子和細(xì)胞類型。例如，表觀遺傳編輯以組蛋白H3K27甲基化的方式抑制基因表達(dá)，且這種抑制作用具有位點(diǎn)特異性；而表觀遺傳編輯組蛋白乙酰化或H3K4me3雖然編輯成功，但并非所有基因都能被激活。一項(xiàng)關(guān)于環(huán)境依賴性的系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H3K36me3的表觀遺傳編輯靶向含有CTCF的位點(diǎn)時(shí)，其有效性較高，但會(huì)被附近的YY1轉(zhuǎn)錄因子基序所抑制。鑒于此復(fù)雜性，需要采用系統(tǒng)方法來定義編輯器、靶位點(diǎn)和染色質(zhì)環(huán)境的“相互作用規(guī)則”。預(yù)測(cè)表觀遺傳編輯結(jié)果所需的參數(shù)包括：效應(yīng)域在寫入或擦除靶修飾方面的效率；基因組位點(diǎn)的可及性，包括局部異染色質(zhì)的程度；以及內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子招募到靶位點(diǎn)的強(qiáng)度，這既包括修飾讀取器，也包括DNA序列本身。
早期對(duì)表觀遺傳編輯“相互作用規(guī)則”的研究利用了某些鋅指蛋白（ZFPs）的廣泛結(jié)合特性，通過對(duì)全基因組DNA甲基化進(jìn)行表觀遺傳編輯來探究基因抑制機(jī)制。正如預(yù)期的那樣，DNA甲基化水平的升高抑制了許多基因位點(diǎn)的基因表達(dá)。然而，DNA甲基化編輯和基因抑制的效率因位點(diǎn)而異。低表達(dá)基因比高活性基因更容易發(fā)生DNA甲基化。此外，活性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的甲基化水平升高會(huì)抑制基因表達(dá)，而抑制性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的甲基化則會(huì)導(dǎo)致基因上調(diào)。DNA甲基化編輯的其他特性也有助于提高其效率，例如CpG的密度、核小體定位和替代轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）的使用。
最后，為了確?；虮磉_(dá)的變化是靶向表觀遺傳編輯的直接原因，關(guān)鍵的對(duì)照實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。對(duì)照實(shí)驗(yàn)的選擇較為復(fù)雜，可以包括：第一，單獨(dú)的DBD；第二，DBD與催化失活的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合；第三，單獨(dú)的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域；以及第四，非靶向或安全位點(diǎn)結(jié)合的DBD與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域融合。第一和第二個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以確定DBD（融合蛋白）本身是否通過空間位阻干擾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、組蛋白和DNA修飾酶或調(diào)控染色質(zhì)可及性的核小體來調(diào)控基因表達(dá)。第二個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)對(duì)于排除其他內(nèi)源性效應(yīng)因子的非特異性募集所產(chǎn)生的任何間接影響也很重要。第三和第四個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)可以確定效應(yīng)結(jié)構(gòu)域是否募集到非靶向的內(nèi)源性位點(diǎn)，從而間接調(diào)控靶基因位點(diǎn)。具有廣泛作用的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵例子包括p300，它通過其非催化結(jié)構(gòu)域募集轉(zhuǎn)錄因子；以及催化失活的DNMT3A，它通過與其伴侶DNMT3L的二聚化募集內(nèi)源性DNMT3A。對(duì)LSD1的研究也強(qiáng)調(diào)了效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜性以及多重調(diào)控的必要性：盡管靶向募集這種組蛋白去甲基化酶可以消除H3K4甲基化并抑制活性增強(qiáng)子，但LSD1的催化失活對(duì)全基因組基因表達(dá)的影響有限。然而，全長LSD1的缺失可以解除全基因組增強(qiáng)子的抑制，這表明LSD1可以通過募集其他染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子來獨(dú)立于其催化去甲基化酶功能發(fā)揮抑制作用。因此，精心選擇和設(shè)計(jì)控制效應(yīng)因子對(duì)于確定表觀遺傳編輯對(duì)基因表達(dá)的直接影響至關(guān)重要。
選擇最佳靶向位置。盡管表觀遺傳編輯足以調(diào)控基因表達(dá)已是公認(rèn)的事實(shí)，但仍需開展更多研究來確定每個(gè)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域或組合的最佳靶向位置。為了確定啟動(dòng)子周圍的最佳靶向窗口，一些開創(chuàng)性研究利用ATF dCas9–KRAB（CRISPR interference，CRISPRi）進(jìn)行了混合生長篩選，并使用針對(duì)多個(gè)啟動(dòng)子周圍數(shù)千個(gè)位點(diǎn)的向?qū)NA（gRNA）覆蓋文庫。這些研究表明，當(dāng)靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）下游約100 bp范圍內(nèi)時(shí)，dCas9–KRAB最為有效。相比之下，使用KRAB–dCas9–DNMT3A3L融合蛋白（CRISPRoff，包含DNA甲基化的直接寫入器）進(jìn)行的類似混合單向?qū)NA (sgRNA) 高通量篩選表明，當(dāng)招募到TSS上游或下游約500 bp處時(shí)，它可以有效地沉默，因此與單獨(dú)使用KRAB相比，它在啟動(dòng)子周圍顯示出更廣泛的有效靶向窗口。
盡管目前討論的大多數(shù)研究都是通過靶向基因啟動(dòng)子來調(diào)控基因表達(dá)，但有效的表觀遺傳編輯也可以發(fā)生在其他基因調(diào)控元件上，包括絕緣子和增強(qiáng)子。作為概念驗(yàn)證，各種利用dCas9–KRAB的間接靶向的高通量方法已用于識(shí)別增強(qiáng)子并將其與靶基因連接起來。然而，靶向這些基因調(diào)控元件對(duì)基因表達(dá)的影響通常取決于基因位點(diǎn)的特定結(jié)構(gòu)和調(diào)控邏輯。事實(shí)上，最近一項(xiàng)使用雙向ATFs（CRISPR activation and inhibition（CRISPRai））的研究表明，靶向“守門員”或顯性增強(qiáng)子時(shí)，對(duì)基因表達(dá)有顯著影響；而當(dāng)基因受多個(gè)冗余增強(qiáng)子調(diào)控時(shí)，影響則較弱。盡管未來的研究將確定最佳靶點(diǎn)和效應(yīng)域，但毫無疑問，表觀遺傳編輯在許多情況下對(duì)基因表達(dá)具有指導(dǎo)意義。
位點(diǎn)特異性
位點(diǎn)特異性的表觀遺傳編輯（圖 2b）依賴于DNA結(jié)合域 (DBD) 和表觀遺傳效應(yīng)域的特征。盡管ZFP和TALE DBD的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)具有挑戰(zhàn)性，但這些工具已在許多研究中實(shí)現(xiàn)了靶向特異性，包括體內(nèi)研究。ZFP和TALE的靶向特異性因其在基因編輯工具臨床應(yīng)用中的潛力而得到強(qiáng)調(diào)。ZFP的設(shè)計(jì)已通過基于490億個(gè)蛋白質(zhì)-DNA相互作用訓(xùn)練的創(chuàng)新深度學(xué)習(xí)模型得到進(jìn)一步優(yōu)化。另一方面，CRISPR使用簡單的sgRNA設(shè)計(jì)來促進(jìn)基因特異性募集。盡管CRISPR設(shè)計(jì)簡便，但由于sgRNA-DNA錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致一些脫靶結(jié)合，因此靶向特異性并不能得到保證。為了提高靶向特異性，CRISPR工程技術(shù)的進(jìn)步包括利用 CRISPR 變體、對(duì) sgRNA 進(jìn)行化學(xué)修飾、對(duì) CRISPR 平臺(tái)進(jìn)行誘變以及使用脫靶預(yù)測(cè)算法。然而，這些方法主要針對(duì) Cas9 核酸酶，而非用于表觀遺傳編輯的dCas9。最終，基于更小的尺寸、DNA結(jié)合模式（不會(huì)破壞DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)）以及更佳的免疫原性，ZFP或TALE可能比CRISPR 更具臨床應(yīng)用價(jià)值，而首個(gè)臨床表觀遺傳編輯試驗(yàn)實(shí)際上正是利用了ZFP平臺(tái)。
許多研究已證實(shí)表觀遺傳編輯具有特異性，例如在原代人造??細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs）中利用dCas介導(dǎo)的DNA甲基化編輯，以及在肝臟中將鋅指蛋白（ZF）與DNMT3A和KRAB融合。然而，表觀遺傳效應(yīng)分子的選擇也會(huì)影響特異性，某些效應(yīng)分子會(huì)導(dǎo)致全基因組范圍內(nèi)的脫靶修飾。脫靶表觀遺傳編輯會(huì)抑制細(xì)胞生長并促進(jìn)細(xì)胞死亡，從而阻礙穩(wěn)定表達(dá)表觀遺傳編輯分子的細(xì)胞系的構(gòu)建，例如TET1、p300和DNMT3A。事實(shí)上，DNMT3A的分離催化結(jié)構(gòu)域的表達(dá)對(duì)細(xì)胞具有毒性，這一點(diǎn)已得到充分證實(shí)。僅融合催化核心或?qū)π?yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行合理改造可能比全長內(nèi)源性效應(yīng)蛋白更能提高療效，但并非總能有效提高特異性。遠(yuǎn)端基因組相互作用也可能導(dǎo)致脫靶表觀遺傳編輯，盡管有時(shí)這可能是一種受調(diào)控的、有益的結(jié)果。例如，針對(duì)年齡相關(guān)基因PDE4C或FHL2的靶向DNA甲基化，導(dǎo)致其他年齡相關(guān)CpG位點(diǎn)的甲基化，這可能增強(qiáng)了初始編輯的功能。實(shí)現(xiàn)等位基因特異性表觀遺傳編輯，是展現(xiàn)其特異性潛力的有趣例證。這些成就與蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的創(chuàng)新相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了適用于臨床應(yīng)用的靶向特異性，這一點(diǎn)尤為重要，因?yàn)樵S多傳統(tǒng)療法，例如化療藥物或表觀遺傳藥物，遠(yuǎn)非靶向特異性。
表觀遺傳沉默基因的可及性
早期對(duì)表觀遺傳編輯的研究指出，結(jié)合效率是激活表觀遺傳沉默基因的限制因素，因?yàn)楫惾旧|(zhì)對(duì)表觀遺傳編輯器的可及性可能有限（圖2c）。大量研究針對(duì)這一潛在局限性發(fā)現(xiàn)，ATFs和通常較大的直接表觀遺傳編輯劑均能成功激活沉默的基因，包括胎兒基因和腫瘤抑制基因。盡管這些研究證實(shí)，異染色質(zhì)不會(huì)阻止表觀遺傳編輯因子的進(jìn)入，但它確實(shí)會(huì)影響動(dòng)力學(xué)、結(jié)合力和基因組編輯結(jié)果。事實(shí)上，聯(lián)合靶向轉(zhuǎn)錄激活因子或使用表觀遺傳藥物等組合方法，可以提高Cas9在沉默的異染色質(zhì)位點(diǎn)的活性，并且可能也可用于提高表觀遺傳編輯的效率。實(shí)際上，表觀遺傳效應(yīng)融合蛋白的龐大體積可能會(huì)阻礙表觀遺傳編輯的可及性和效率。解決這一問題的方法包括靶向催化結(jié)構(gòu)域而非全長效應(yīng)蛋白、使用基于模塊的效應(yīng)蛋白（例如SunTag和MS2）以及使用小型DNA結(jié)合域（例如源自鋅指蛋白或CRISPR變體的DNA結(jié)合域）。
誘導(dǎo)表觀遺傳重編程的穩(wěn)定性
直接表觀遺傳編輯的一大優(yōu)勢(shì)在于，表觀遺傳修飾酶或擦除酶瞬時(shí)表達(dá)后，基因調(diào)控仍能持續(xù)進(jìn)行。這種持續(xù)的基因調(diào)控與CRISPR基因組編輯一樣有效，但避免了永久性基因組改變帶來的風(fēng)險(xiǎn)和副作用。直接表觀遺傳編輯在特定情況下（詳見下文）甚至在體內(nèi)模型中（方框 4）都實(shí)現(xiàn)了持續(xù)的基因沉默，但預(yù)測(cè)表觀遺傳編輯在移除后哪些表觀遺傳修飾能夠維持仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)（圖 2d）。揭示表觀遺傳編輯維持的確切機(jī)制是基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用領(lǐng)域的一個(gè)活躍研究方向。
高膽固醇血癥表觀遺傳編輯的臨床前里程碑
一系列針對(duì)PCSK9的突破性研究已確立表觀遺傳編輯作為治療高膽固醇血癥的有效策略。PCSK9促進(jìn)LDL受體降解，從而升高膽固醇水平。這些研究利用靶向DNA甲基化和間接組蛋白抑制來沉默PCSK9，從而在不改變DNA序列的情況下實(shí)現(xiàn)持久的基因調(diào)控。首次在體內(nèi)靶向沉默以降低膽固醇的研究表明，可以使用腺相關(guān)病毒（AAV）遞送的CRISPR-dSaCas9-KRAB系統(tǒng)進(jìn)行長期表達(dá)，以抑制小鼠體內(nèi)的PCSK9表達(dá)。血清膽固醇水平至少降低了24周。這是首次證明轉(zhuǎn)錄抑制可以作為治療高膽固醇血癥的有效方法。
將 KRAB 與 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 3A 和 3L(DNMT3A3L) 以鋅指融合蛋白（稱為進(jìn)化工程轉(zhuǎn)錄抑制因子 (EvoETR)）結(jié)合，并通過脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 以 mRNA 形式遞送，單次給藥即可將 PCSK9 水平降低約 50%，且效果持續(xù)近 1 年——即使在肝臟再生后——這表明表觀遺傳標(biāo)記具有有絲分裂穩(wěn)定性。
將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于靈長類動(dòng)物，使用 LNP 遞送與 KRAB、DNMT3A和 DNMT3L (DNMT3A3L) 融合的CRISPR-dCas9，可使食蟹猴循環(huán) PCSK9 水平降低約 90%，LDL 膽固醇水平降低約70%，且效果至少持續(xù) 1 年。值得注意的是，使用dCas9-TET1 激活劑可以完全逆轉(zhuǎn)基因沉默。
有趣的是，在獨(dú)立研究中，使用另一種表觀遺傳效應(yīng)因子（轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子 (TALE)-MQ1，以 mRNA 形式通過 LNP 遞送）和另一種 Cas 變體（OMEGAoff，通過 AAV76 遞送）也證實(shí)了 PSCD9 的體內(nèi)長期沉默。
這些研究共同標(biāo)志著一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)：無需基因組修飾即可實(shí)現(xiàn)可編程、持久且可逆的基因沉默，正朝著臨床應(yīng)用邁進(jìn)。
當(dāng)靶點(diǎn)是細(xì)胞身份的主調(diào)控因子時(shí)，評(píng)估表觀遺傳編輯后的穩(wěn)定性可能會(huì)變得復(fù)雜，例如在細(xì)胞分化模型中。在這些情況下，當(dāng)靶基因影響全局表觀基因組和基因調(diào)控?絡(luò)時(shí)，直接表觀遺傳編輯因子（甚至是ATFs）的瞬時(shí)表達(dá)即可產(chǎn)生持續(xù)效應(yīng)。例如，在胚胎?細(xì)胞中，瞬時(shí)表達(dá)ATF dCas-VPR激活兩個(gè)基因就足以誘導(dǎo)自組織形成可重復(fù)的胚胎模型。類似地，ATF dCas9-VP64激活Sox1可誘導(dǎo)神經(jīng)元分化。值得注意的是，當(dāng)Sox1同時(shí)被DNA去甲基化酶dCas?TET1和轉(zhuǎn)錄激活因子靶向時(shí)，神經(jīng)元分化效率更高。盡管這些結(jié)果為再生醫(yī)學(xué)帶來了巨大的希望，但其持續(xù)效果可歸因于細(xì)胞分化程序的啟動(dòng)，而無法深入了解目標(biāo)位點(diǎn)表觀遺傳編輯的維持。
早期研究表明，靶向啟動(dòng)子的DNA甲基化可導(dǎo)致持續(xù)的基因抑制，盡管并非所有基因的反應(yīng)都相同。在乳腺癌模型中，使用ZF?DNMT3A（而非ZF?KRAB）可實(shí)現(xiàn)SOX2的持續(xù)沉默，而使用dCas9?DNMT3A3L可維持CDKN2A、RASSF1、HIC1和PTEN的沉默。然而，當(dāng)ZF?DNMT3A靶向VEGFA時(shí)，并未觀察到持續(xù)效應(yīng)。使用具有廣泛結(jié)合能力的ZF?DNMT3A進(jìn)行的全基因組DNA甲基化研究進(jìn)一步證實(shí)了DNA甲基化的維持具有情境依賴性，并闡明了該現(xiàn)象的一般特征。首先，DNA甲基化在至少1周內(nèi)維持在約25%的靶位點(diǎn)。第二，維持與抑制性H3K27me3的基礎(chǔ)富集相關(guān)，這可能與靶向DNA甲基化協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的基因沉默。第三，DNA甲基化丟失速率是可變的，反映了轉(zhuǎn)錄因子激活劑和TET去甲基酶的動(dòng)態(tài)募集。在激活轉(zhuǎn)錄因子存在的情況下，證明有效基因沉默的一個(gè)巧妙方法是，通過特異性地進(jìn)行DNA甲基化來沉默突變等位基因，同時(shí)允許野生型等位基因保持活性。盡管這種針對(duì)SNP的沉默（以及激活）在表觀遺傳編輯劑稀釋后，仍能在部分位點(diǎn)上維持?jǐn)?shù)天，但仍需進(jìn)行更長時(shí)間的測(cè)量以確定表觀遺傳記憶。這種等位基因特異性表觀遺傳編輯具有許多潛在的臨床應(yīng)用，包括沉默顯性癌基因和糾正異常印記模式。
與抑制通路在維持表觀遺傳記憶中的協(xié)同作用一致，組合靶向抑制性表觀遺傳編輯可增強(qiáng)基因沉默的維持。一項(xiàng)開創(chuàng)性研究表明，在K562細(xì)胞中，使用dCas9或TALE DBDs組合靶向B2M、IFNAR1和VEGFA后，KRAB和DNMT3A3L對(duì)維持具有協(xié)同效應(yīng)。類似地，靶向CXCR4和PDCD1/LAG3的KRAB-TALE-DNMT3A3L融合蛋白在T細(xì)胞中導(dǎo)致持續(xù)的基因沉默，但當(dāng)靶向CCR5啟動(dòng)子時(shí)，僅獲得短暫的沉默，這再次表明維持具有環(huán)境特異性。該領(lǐng)域的突破是CRISPRoff的引入，它是一種一體化的KRAB?dCas9?DNMT3A3L融合蛋白；首次使用該組合進(jìn)行的全基因組生長篩選誘導(dǎo)了許多基因的持續(xù)抑制。然而，一些基因無法通過瞬時(shí)CRISPRoff靶向穩(wěn)定沉默。有趣的是，將dCas9–KRAB（與H3K9me3相關(guān)）與dCas9–Ezh2（寫入H3K37me3）交換，可以在某些dCas9–KRAB/dCas9–DNMT3A和DNMT3L無反應(yīng)基因中誘導(dǎo)持續(xù)效應(yīng)。盡管KRAB經(jīng)常被納入其中，但僅使用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行直接表觀遺傳編輯表明，在某些情況下，包括體內(nèi)（例如非分裂腦細(xì)胞和肝臟），可以實(shí)現(xiàn)維持。
盡管表觀遺傳編輯在維持基因沉默方面取得了成功（參見方框4），但穩(wěn)定的基因激活可能更具挑戰(zhàn)性，因?yàn)檫@不僅需要寫入激活標(biāo)記和擦除現(xiàn)有的抑制標(biāo)記，還需要內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以募集轉(zhuǎn)錄機(jī)制并抑制異染色質(zhì)的形成。事實(shí)上，一種有效的持續(xù)基因激活策略是編輯啟動(dòng)子DNA序列，以引入內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)內(nèi)源性激活轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)存在時(shí)，例如通過CRISPRoff等方法沉默的基因，使用dCas9-TET1進(jìn)行表觀遺傳編輯以去除DNA甲基化可以導(dǎo)致持續(xù)的基因重新激活。這種方法最近在小鼠中得到了證實(shí)，證明了表觀遺傳基因沉默的可逆性。盡管DNA甲基化沉默基因的上調(diào)可通過與TET1共同募集p65-RTA或VPR來改善，但這些間接效應(yīng)因子并不能顯著提高活化維持能力。瞬時(shí)dCas9-TET1-CD表達(dá)誘導(dǎo)的穩(wěn)定再活化也已在人T細(xì)胞中FOXP3表達(dá)相關(guān)的增強(qiáng)子區(qū)域得到證實(shí)，盡管這種持續(xù)的去甲基化狀態(tài)不足以誘導(dǎo)穩(wěn)定的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型。在這方面，在小鼠原代T細(xì)胞中，慢病毒TET1誘導(dǎo)的Foxp3增強(qiáng)子區(qū)域的去甲基化也未能導(dǎo)致穩(wěn)定的基因表達(dá)（與慢病毒表達(dá)的靶向啟動(dòng)子的dCas9-p300相反）。印記基因可能特別有利于維持激活狀態(tài)，因?yàn)楸磉_(dá)所需的所有轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子都存在并驅(qū)動(dòng)著姊妹等位基因。在這方面，最近一項(xiàng)研究證實(shí)，對(duì)一個(gè)受抑制基因座的一個(gè)等位基因進(jìn)行去甲基化可以導(dǎo)致基因的持續(xù)重新表達(dá)。一項(xiàng)針對(duì)普拉德-威利綜合征中異常印記的SNRPN基因的有前景的臨床前研究發(fā)現(xiàn)，通過dCas9-TET1進(jìn)行的DNA去甲基化可以維持激活狀態(tài)長達(dá)7周，甚至在神經(jīng)元分化過程中也是如此。這些例子表明，在某些情況下，去除DNA甲基化可以導(dǎo)致表觀遺傳基因的持續(xù)激活。
除了DNA去甲基化之外，活性組蛋白修飾的表觀遺傳編輯也能維持轉(zhuǎn)錄激活，但其效果也取決于具體情況。例如，將H3K4me3寫入酶PRDM9瞬時(shí)募集到未發(fā)生DNA甲基化的基因上，可導(dǎo)致基因持續(xù)激活；而靶向DNA甲基化的沉默靶基因則僅導(dǎo)致瞬時(shí)激活。有趣的是，將dCas9?PRDM9與dCas9?DOT1L（可寫入H3K79me2）共同靶向DNA甲基化位點(diǎn)似乎能增強(qiáng)這種維持作用。除了基因位點(diǎn)變異外，沉默和激活的表觀遺傳記憶也因細(xì)胞類型而異，盡管其規(guī)律尚待確定。維持這種沉默所需的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子的可用性可能是關(guān)鍵因素。例如，最近一項(xiàng)研究表明，在胚胎?細(xì)胞中刪除染色質(zhì)因子DPPA2可增強(qiáng)KRAB介導(dǎo)的基因沉默的持久性。
最終，已發(fā)表的研究表明，通過指定效應(yīng)因子、基因位點(diǎn)和細(xì)胞類型，可以實(shí)現(xiàn)持續(xù)的表觀遺傳編輯?，F(xiàn)在的挑戰(zhàn)在于預(yù)測(cè)這種響應(yīng)性，而尋找通用規(guī)則以及開發(fā)作用于特定（治療性）基因位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域組合仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
動(dòng)物研究中直接表觀遺傳編輯的治療前景
前文討論的研究凸顯了表觀遺傳編輯作為一種多功能體外研究工具的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。然而，其在動(dòng)物模型中的有效性也得到了廣泛的研究。體內(nèi)表觀遺傳編輯已被證明對(duì)于明確特定表觀遺傳修飾與疾病相關(guān)基因失調(diào)的直接因果關(guān)系至關(guān)重要；并且有助于區(qū)分單個(gè)基因位點(diǎn)表觀遺傳修飾的直接效應(yīng)和全基因組改變的效應(yīng)。此外，許多體內(nèi)研究也證實(shí)了表觀遺傳編輯作為一種治療策略的潛力。
以下綜述了體內(nèi)表觀遺傳編輯的研究，重點(diǎn)關(guān)注直接表觀遺傳編輯器。這些研究可分為四類（表3和圖3）。第一類涉及通過轉(zhuǎn)基因表達(dá)表觀遺傳編輯器構(gòu)建的動(dòng)物模型。第二類涉及由經(jīng)表觀遺傳編輯器瞬時(shí)處理的胚胎?細(xì)胞衍生的動(dòng)物模型。第三類涉及移植經(jīng)表觀遺傳編輯器體外重編程的細(xì)胞。第四類涉及將表觀遺傳編輯器應(yīng)用于疾病模型。
第一類和第二類研究
許多轉(zhuǎn)基因小鼠已被構(gòu)建為組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)dCas，但這些方法主要利用間接表觀遺傳編輯技術(shù)，通過靶向轉(zhuǎn)錄激活因子（如VP64或其衍生物，例如dCas-VPR在神經(jīng)元或心肌細(xì)胞中表達(dá)受限的小鼠）或轉(zhuǎn)錄抑制因子（如KRAB）來調(diào)控特定基因的表達(dá)，而無需直接修飾表觀基因組。一項(xiàng)值得注意的研究將dCas9-KRAB轉(zhuǎn)基因小鼠模型與sgRNA-MS2和MCP-LSD1的病毒表達(dá)相結(jié)合，其中MCP與sgRNA分子中的MS2序列結(jié)合，以研究增強(qiáng)子調(diào)控造血的功能。該三方抑制系統(tǒng)消耗了染色質(zhì)修飾H3K4me1，并間接消耗了H3K27ac，同時(shí)富集了抑制性H3K9me3，尤其是在靶向增強(qiáng)子處。
此外，Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠已被用于來研究間接調(diào)控基因表達(dá)的表觀遺傳編輯，通過遞送截短的sgRNA阻止DNA切割，例如，MS2系統(tǒng)募集HP1a?KRAB來沉默Myd88基因。這種方法也已應(yīng)用于豬模型中的基因激活，該模型使用Dox誘導(dǎo)型SpCas9和截短的sgRNA，并利用MS2?p65?HSF1 (MPH)系統(tǒng)；與嚙齒動(dòng)物相比，豬的免疫系統(tǒng)更加接近人類，因此是有價(jià)值的動(dòng)物模型。表達(dá)直接表觀遺傳編輯的轉(zhuǎn)基因模型將成為研究體內(nèi)疾病相關(guān)基因表觀遺傳調(diào)控的寶貴工具，因?yàn)樗梢钥朔《具f送因表觀遺傳編輯分子體積較大而造成的尺寸限制。據(jù)我們所知，目前僅有少數(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型被報(bào)道用于評(píng)估直接表觀遺傳編輯融合構(gòu)建體的效果。
第一個(gè)此類轉(zhuǎn)基因模型表達(dá)了dCas9–SunTag，將Tet1靶向H19基因，以模擬Silver–Russell綜合征。類似地，有報(bào)道稱，一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型利用神經(jīng)元特異性啟動(dòng)子將dCas?SunTag（募集DNMT3A）的表達(dá)限制在神經(jīng)元中。該模型表達(dá)靶向Snrpn的sgRNA后，成功用于緩解Angelman綜合征的表型。另一種表觀遺傳編輯轉(zhuǎn)基因模型表達(dá)Cre依賴的dCas9?p300，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)dCas9?p300表達(dá)的時(shí)間和區(qū)域控制。令人鼓舞的是，將 Cre 和Pdx1 sgRNA 通過AAV 遞送至 dCas9-p300 小鼠肝臟可增加Pdx1 mRNA 和蛋白水平，并伴隨Pdx1 基因座 H3K27Ac 的富集。然而，研究報(bào)道了脫靶差異基因表達(dá)，且即使在沒有 Cre 或 sgRNA 表達(dá)的情況下，H3K27Ac富集仍然普遍存在。這種非特異性基因激活可能是由于 p300 組成型活性催化結(jié)構(gòu)域的“泄漏”表達(dá)所致；其他研究也報(bào)道了 p300 的非特異性作用。
另一種構(gòu)建表觀遺傳疾病動(dòng)物模型的方法是，在早期發(fā)育階段瞬時(shí)表達(dá)表觀遺傳編輯因子，以誘導(dǎo)目標(biāo)基因（表3中的II類）發(fā)生持久的表觀遺傳重編程。例如，靶向DNA去甲基化或甲基化可以模擬印記疾病、自閉癥和神經(jīng)發(fā)育障礙。令人興奮的是，通過使用dCas9?Dnmt3a和dCpf1?Tet1同時(shí)靶向8個(gè)基因座印記控制區(qū)域，分別下調(diào)或上調(diào)其靶基因，可以將mRNA與其相應(yīng)的sgRNA共遞送至未受精卵母細(xì)胞，從而獲得可存活的后代，盡管效率較低。據(jù)我們所知，目前尚無嘗試使用直接組蛋白表觀遺傳編輯構(gòu)建動(dòng)物疾病模型。
四項(xiàng)超越傳統(tǒng)動(dòng)物模型的研究揭示了利用直接表觀遺傳編輯技術(shù)研究物種特異性表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的方法，這些研究分別應(yīng)用了dCas9-Dnmt7和dCas9-Tet2在斑馬魚胚胎中、dCas9-SunTag-DNMT3A在蝸牛中、dCas9-olEzh2在日本鳉魚中以及dCas9-LSD1在雞胚胎中。盡管這些研究并未將其用作動(dòng)物疾病模型，但它們凸顯了早期胚胎或發(fā)育階段表觀遺傳編輯技術(shù)在構(gòu)建不同物種疾病模型方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。
轉(zhuǎn)基因模型和早期胚胎表達(dá)模型均不足以證明表觀遺傳編輯的治療效果。為了證明基因靶向DNA或組蛋白修飾的真正治療效果，表觀遺傳編輯器的瞬時(shí)表達(dá)必須能夠特異性且穩(wěn)定地修飾表觀基因組，有效調(diào)控基因表達(dá)并挽救疾病表型。為了闡明直接表觀遺傳編輯的治療前景，下文將首先回顧體外表觀遺傳重編程細(xì)胞的移植研究（表3中標(biāo)記為III類），其次回顧體內(nèi)遞送表觀遺傳編輯器的治療效果（IV類）（圖3）。
第三類研究
鑒于在體內(nèi)高效且細(xì)胞類型特異性地遞送大尺寸催化表觀遺傳編輯分子的挑戰(zhàn)，通過表觀遺傳編輯在體外重編程細(xì)胞，然后移植重編程后的細(xì)胞，為某些疾病開辟了新的研究和治療途徑（表3）。例如，移植經(jīng)TALE-TET1重編程的β細(xì)胞以誘導(dǎo)β細(xì)胞增殖，在糖尿病治療方面極具前景，目前正在探索其他途徑。此外，將表觀遺傳編輯的造血干細(xì)胞移植到小鼠骨髓后，結(jié)果表明靶向DNA甲基化在分化過程中得以維持，從而可以研究沉默p15對(duì)造血的影響。大多數(shù)描述直接表觀遺傳編輯細(xì)胞異種移植的研究都集中在腫瘤學(xué)和神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域（表3），如下所述。
在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，疾病模型通常通過以下方法獲得：將腫瘤細(xì)胞注射到動(dòng)物體內(nèi)，在異種移植前進(jìn)行基因操作，以評(píng)估干預(yù)措施的功能效應(yīng)。DNA甲基化編輯的效果已在體內(nèi)得到證實(shí)，方法是使用經(jīng)過基因工程改造的腫瘤細(xì)胞系，這些細(xì)胞系能夠穩(wěn)定表達(dá)ZF-DNMT3A、TALE-TET1或dCas融合蛋白。重要的是，CRISPRoff的瞬時(shí)表達(dá)能夠沉默MGMT的表達(dá)，并使腦內(nèi)注射的原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺更加敏感。這些研究均支持直接表觀遺傳編輯單個(gè)癌癥相關(guān)基因（見表3）（單獨(dú)或與化學(xué)藥物聯(lián)合使用）的治療意義，從而降低腫瘤的侵襲性。
通過直接表觀遺傳編輯組蛋白修飾，也已證實(shí)了調(diào)控單個(gè)癌癥相關(guān)基因表達(dá)的治療潛力。例如，注射穩(wěn)定表達(dá)dCas9?p300的復(fù)發(fā)性腫瘤細(xì)胞以激活Par4，可抑制乳腺癌腫瘤生長并提高生存率。鑒于Par4表觀遺傳編輯可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，即使是短暫的Par4激活也可能提高現(xiàn)有療法的療效。一項(xiàng)針對(duì)小鼠結(jié)直腸癌的研究應(yīng)用慢病毒表達(dá)dCas9?HDAC3來降低Dpp4啟動(dòng)子H3K27ac的水平，從而降低Dpp4的表達(dá)、腫瘤大小以及最重要的降低死亡率。在這些研究中，表觀遺傳編輯穩(wěn)定表達(dá)，因此，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究來確定表觀遺傳編輯的持久性和長期治療潛力。
體外移植研究也探索了表觀遺傳編輯在神經(jīng)發(fā)育疾病（例如雷特(Rett)綜合征和脆性X綜合征(FXS)）中的應(yīng)用。這些疾病的特征是關(guān)鍵發(fā)育基因（分別為MECP2和FMR1）的表觀遺傳失調(diào)，臨床前研究顯示直接表觀遺傳編輯在這些基因中具有應(yīng)用前景。在FXS小鼠模型中，Fmr1表達(dá)受到抑制，而移植經(jīng)靶向Fmr1的dCas9-TET1處理的體外誘導(dǎo)多能?細(xì)胞可以挽救該小鼠的表型。他們?cè)缙诶脠?bào)告基因小鼠進(jìn)行的研究具有兩項(xiàng)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)化意義。首先，直接的表觀遺傳編輯足以激活FXS小鼠模型培養(yǎng)的有絲分裂后神經(jīng)元中的Fmr1表達(dá)。這一點(diǎn)值得注意，因?yàn)橹貜?fù)序列擴(kuò)增的FMR1處于異染色質(zhì)狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄受到抑制。其次，在胚胎細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)dCas9?TET1和sgRNA的慢病毒足以維持神經(jīng)元中Fmr1的持續(xù)激活，即使在移植后長達(dá)3個(gè)月也是如此。這種持續(xù)激活表明，在dCas9?TET1存在的情況下，Fmr1的內(nèi)源性抑制機(jī)制并未凌駕于表觀遺傳編輯之上。由于該構(gòu)建體是通過慢病毒遞送穩(wěn)定表達(dá)的，因此尚不清楚瞬時(shí)表觀遺傳編輯是否會(huì)產(chǎn)生類似的效果。未來需要開展研究，以利用瞬時(shí)遞送方法在體內(nèi)維持Fmr1的直接表觀遺傳編輯。一項(xiàng)補(bǔ)充研究將表觀遺傳編輯應(yīng)用于來自Rett綜合征患者的人類胚胎?細(xì)胞（ES細(xì)胞），這些患者的X連鎖MECP2基因的一個(gè)等位基因發(fā)生了突變。靶向失活X染色體上野生型MECP2的dCas9-TET1足以去除MECP2的甲基并激活其表達(dá)，從而挽救人類ES細(xì)胞衍生神經(jīng)元的缺陷。盡管后一項(xiàng)研究并未將編輯后的神經(jīng)元移植到Rett綜合征小鼠模型中，但這些研究強(qiáng)調(diào)了表觀遺傳編輯在神經(jīng)發(fā)育疾病中的巨大治療潛力。
總之，我們對(duì)表觀遺傳編輯的理解隨著體外重編程細(xì)胞移植研究和疾病動(dòng)物模型的構(gòu)建而不斷加深。例如，對(duì)原始細(xì)胞進(jìn)行體外重編程，用于再生醫(yī)學(xué)，是表觀遺傳編輯的另一項(xiàng)強(qiáng)大應(yīng)用，但表觀遺傳編輯的真正潛力在于對(duì)體細(xì)胞疾病細(xì)胞進(jìn)行重編程。下文將全面總結(jié)直接表觀遺傳編輯劑（IV類）在各種臨床前疾病模型中的治療效果，并重點(diǎn)介紹瞬時(shí)遞送表觀遺傳編輯劑后療效的持久性（表3）。
第四類研究
組蛋白修飾的編輯。體內(nèi)表觀遺傳編輯最初是通過直接重寫組蛋白修飾而發(fā)現(xiàn)的，并應(yīng)用于精神疾病的研究。抑郁癥和成癮這兩種高度普遍的精神疾病反映了內(nèi)側(cè)皮質(zhì)邊緣回路的功能失調(diào)，是由潛在的表觀遺傳和/或遺傳易感性與長期暴露于壓力或藥物之間的相互作用引起的。開創(chuàng)性的臨床前研究已證實(shí)，在體內(nèi)可以直接對(duì)Fosb基因進(jìn)行表觀遺傳編輯，該基因編碼成癮和抑郁癥的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。在小鼠腦中瞬時(shí)表達(dá)Fosb?ZF?G9a可阻斷可卡因誘導(dǎo)的Fosb表達(dá)和獎(jiǎng)賞行為及攻擊性降低。這些行為效應(yīng)的持久性尚不清楚，因?yàn)樗羞@些效應(yīng)都是在表觀遺傳編輯器的瞬時(shí)表達(dá)期間測(cè)量的。
活動(dòng)誘導(dǎo)的即刻早期基因（如Fosb）的瞬時(shí)表達(dá)是神經(jīng)元可塑性的關(guān)鍵機(jī)制，并伴隨著即刻早期基因啟動(dòng)子的瞬時(shí)乙?；?。包括Arc、Fos、Fosb、Nr4a1和Npas4在內(nèi)的這些基因是神經(jīng)表觀遺傳編輯文獻(xiàn)中的重要靶點(diǎn)。在小鼠海?中利用dCas9?HDAC8對(duì)Fos進(jìn)行表觀遺傳編輯，可減少高表達(dá)Fos的海?神經(jīng)元數(shù)量。一項(xiàng)后續(xù)研究利用dCas9?p300轉(zhuǎn)基因小鼠靶向Fos增強(qiáng)子的乙?；?，結(jié)果顯示內(nèi)源性神經(jīng)元生理功能和信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)。為了應(yīng)對(duì)腦組織中數(shù)千種相互交織的異質(zhì)細(xì)胞類型，近期研究在小鼠腦中應(yīng)用了細(xì)胞類型特異性的表觀遺傳編輯器表達(dá)。神經(jīng)元亞型特異性的瞬時(shí)表達(dá)Fosb?ZF?G9a足以在Fosb?ZF?G9a表觀遺傳編輯器表達(dá)后至少4天內(nèi)誘導(dǎo)抑郁樣行為。
大腦中即刻早期基因的激活會(huì)導(dǎo)致下游靶基因的激活，而這些靶基因?qū)τ谏窠?jīng)元可塑性至關(guān)重要。Fosb的一個(gè)靶基因是Cdk5，它編碼一種神經(jīng)元特異性激酶，該激酶參與獎(jiǎng)賞加工、應(yīng)激和記憶。利用Cdk5-ZF–G9a進(jìn)行表觀遺傳編輯，研究人員在創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)、可卡因獎(jiǎng)賞和應(yīng)激小鼠模型中確定了Cdk5的表觀遺傳調(diào)控。最后，一項(xiàng)針對(duì)酒精使用障礙的研究將dCas9–p300靶向一個(gè)關(guān)鍵的即刻早期基因增強(qiáng)子Arc。dCas9–p300增加了Arc mRNA、Arc啟動(dòng)子H3K27Ac、Arc SARE增強(qiáng)子RNA(eRNA)的水平，以及Arc SARE與Arc之間的相互作用強(qiáng)度，挽救酒精暴露的行為影響。
除了精神疾病之外，一項(xiàng)早期的體內(nèi)腦研究應(yīng)用靶向SUV39H1，通過H3K9me3富集來抑制Psd95的表達(dá)。這種抑制足以在體內(nèi)調(diào)節(jié)海?神經(jīng)元的突觸和棘突成熟。鑒于FSHD是由DUX4的表觀遺傳去抑制引起的，因此它是表觀遺傳編輯的另一個(gè)關(guān)鍵疾病靶點(diǎn)。利用SUV39H1 SET結(jié)構(gòu)域進(jìn)行表觀遺傳編輯以抑制Dux4，可以挽救FSHD小鼠模型的表型。最后，CRISPR?dCas9-p300增加了肝細(xì)胞中B4galnt2的表達(dá)以及阿爾茨海默病小鼠模型中神經(jīng)元Gad1的表達(dá)，從而改善了記憶缺陷。
這些研究表明，通過組蛋白表觀遺傳編輯調(diào)控單個(gè)基因的表達(dá)，從而干擾疾病的發(fā)病機(jī)制，具有巨大的潛力。盡管染色質(zhì)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控已得到充分證實(shí)，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，某些組蛋白修飾也能強(qiáng)烈預(yù)測(cè)可變剪接。表觀遺傳編輯非常適合用于闡明表觀基因組在可變剪接中的功能作用。在小鼠腦中，dCas9-SET2的表達(dá)能夠富集靶位點(diǎn)的H3K36me3，從而驅(qū)動(dòng)Srsf11的可變剪接，并增強(qiáng)可卡因獎(jiǎng)賞行為。重要的是，在這些案例中，表觀遺傳編輯調(diào)控可變剪接，而沒有改變基因表達(dá)水平。
DNA甲基化編輯。多種遞送方法已被用于誘導(dǎo)大腦中的DNA去甲基化或甲基化編輯（詳見表3）。阿爾茨海默病臨床前模型包括通過慢病毒遞送dCas9?TET1，從而解除對(duì)組織蛋白酶D的抑制，進(jìn)而降解β?淀粉樣蛋白（Aβ）；或遞送dCas9?DNMT3a，從而沉默App（編碼Aβ前體蛋白）。鼻內(nèi)給藥含有靶向Bace1（編碼β?分泌酶1）的dCas9?DNMT3A核糖核蛋白的光誘導(dǎo)外泌體，可減少淀粉樣蛋白病理并改善識(shí)別記憶障礙。在帕金森病的臨床前研究中，使用靶向腦的外泌體遞送dCas9?DNMT3A沉默SNCA（編碼α?突觸核蛋白）可減輕帕金森病樣損傷，而通過質(zhì)粒遞送dCas9?DNMT3A3L沉默小鼠前額葉皮層的Ttr可減輕抑郁樣行為。
直接DNA甲基化編輯在神經(jīng)系統(tǒng)疾病之外的治療效果首次得到證實(shí)，即通過穩(wěn)定表達(dá)dCas9?TET3慢病毒誘導(dǎo)Rasal1和Klotho表達(dá)，從而改善腎纖維化。此外，研究人員首次評(píng)估了在小鼠肝細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)靶向Fgf21的dCas9?SunTag?Tet1進(jìn)行DNA去甲基化時(shí)，即刻編輯的體內(nèi)維持情況。然而，通過尾靜脈注射一體化質(zhì)粒后，其效果在第14天未能維持。如前所述，效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的組合可能有助于提高表觀遺傳重編程的維持效果。事實(shí)上，CRISPRoff（包含DNMT3A3L和KRAB）使MGMT基因沉默。在原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)mRNA電穿孔后，移植后至少10天內(nèi)表達(dá)。令人振奮的最新數(shù)據(jù)表明，使用這三種抑制因子（KRAB、DNMT3A和DNMT3L）作為鋅指融合蛋白來沉默Pcsk9，單次靜脈注射LNP介導(dǎo)的mRNA后，可有效降低膽固醇水平至少1年（而對(duì)于與所有三種蛋白融合的一體化鋅指蛋白，則至少可降低43天）。重要的是，這種鋅指?KRAB即使在強(qiáng)制肝臟再生超過2個(gè)月后，DNMT3A3L對(duì)Pcsk9的沉默作用仍然維持，其效率與傳統(tǒng)基因敲除相當(dāng)。通過瞬時(shí)表達(dá)與TALE融合的細(xì)菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MQ1），Pcsk9基因座DNA甲基化誘導(dǎo)的沉默作用的維持時(shí)間長達(dá)6個(gè)月，這一結(jié)果已得到獨(dú)立證實(shí)（見方框4）。后續(xù)的人源化轉(zhuǎn)基因小鼠和靈長類動(dòng)物研究不僅驗(yàn)證了表觀遺傳編輯的效率和持久性，還證明了通過將TET1靶向PCSK9基因座可逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)的基因沉默。重要的是，體內(nèi)表達(dá)恢復(fù)至少維持了42天。除肝臟外，最近的研究還證明，通過無載體氣道遞送與TET1和TDG（胸腺嘧啶DNA糖苷酶）融合的重組蛋白ZF或dCas9/gRNA，靶向Cxcl11，可在肺部持續(xù)激活基因表達(dá)。通過霧化吸入和鼻內(nèi)溶液相結(jié)合的方法，使小鼠肺上皮細(xì)胞中的Cxcl11去甲基化和去抑制，小鼠獲得了對(duì)?擾素?γ (IFNγ)的反應(yīng)性。
總之，現(xiàn)有關(guān)于體內(nèi)直接表觀遺傳編輯的文獻(xiàn)支持該方法具有巨大的治療潛力，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性疾病和精神疾病方面，早期臨床前研究已顯示出令人鼓舞的結(jié)果。然而，這些研究通常在編輯基因表達(dá)期間評(píng)估結(jié)果，因此對(duì)腦組織中直接表觀遺傳編輯后的表觀遺傳記憶的了解仍然有限。據(jù)我們所知，目前只有一項(xiàng)體內(nèi)研究評(píng)估了腦內(nèi)的長期效應(yīng)。在該研究中，將與未修飾的組蛋白H3尾部（H3K4me0）和非催化性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT3L）結(jié)構(gòu)域融合的鋅指蛋白（ZFs）通過腺相關(guān)病毒（AAV）遞送至腦組織，足以募集內(nèi)源性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶來抑制朊病毒蛋白的表達(dá)，從而保護(hù)腦組織免受朊病毒引起的病理損傷。由于AAV包含一個(gè)自沉默啟動(dòng)子，因此可以確定這種間接誘導(dǎo)的DNA甲基化至少持續(xù)13周。然而，對(duì)于分裂細(xì)胞而言，需要添加KRAB才能維持抑制作用。這一觀察結(jié)果符合以下概念：根據(jù)基因背景的不同，可能需要多種效應(yīng)結(jié)構(gòu)域的組合才能確保穩(wěn)健持久的效應(yīng)。
表觀遺傳編輯的臨床轉(zhuǎn)化
目前至少有14家公司致力于將表觀遺傳編輯技術(shù)應(yīng)用于臨床（表2）。據(jù)披露，這些臨床工具主要通過靶向DNA甲基化或去甲基化來分別抑制或激活病理基因的表達(dá)。
第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的直接表觀遺傳編輯工具，即OTX?2002（Omega Therapeutics10），于2022年11月獲得FDA孤兒藥資格認(rèn)定。OTX?2002可誘導(dǎo)MYC沉默，MYC是一種與超過一半人類癌癥有關(guān)的癌基因。具體而言，OTX?2002應(yīng)用組合表觀遺傳抑制，使用MYC靶向的ZF?MQ1和ZF?KRAB來甲基化DNA，并間接甲基化MYC癌基因附近的組蛋白。遺憾的是，OTX?2002的評(píng)估并未在I/II期MYCHELANGELO I研究之后繼續(xù)進(jìn)行，該研究納入了24名患有肝細(xì)胞癌和其他實(shí)體瘤的患者。
乙型肝炎病毒（HBV）是表觀遺傳療法的另一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。Tune?401（Tune Therapeutics公司）已在西太平洋地區(qū)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，它利用基于CRISPR的DNA甲基化技術(shù)抑制病毒性肝炎基因（包括整合到宿主DNA中的基因和以共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)形式存在的游離體基因），從而治療乙型肝炎。此外，F(xiàn)DA已授予EPI?321（Epicrispr公司）孤兒藥資格，該藥物旨在恢復(fù)FSHD患者DUX4基因座的DNA甲基化，首例患者于2025年接受治療。由于Epicrispr使用dCasMINI（dCas12f），其較小的體積使其能夠通過腺相關(guān)病毒（AAV）進(jìn)行給藥。
多家公司正在研究利用表觀遺傳編輯技術(shù)治療神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海默?。?i>APOEe4）、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（UTRN）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（C9orf72）和面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥（FSHD，DUX4）。Sangamo Biosciences是DNA靶向領(lǐng)域的先驅(qū)公司，已開發(fā)出ZF?KRAB等工具，用于抑制與亨廷頓病相關(guān)的突變型HTT。SLS?004（SEELOS Therapeutics）是一種靶向SNCA的dCas9?DNMT3A，SNCA編碼α?突觸核蛋白，與帕金森病相關(guān)。其他處于臨床應(yīng)用階段的疾病和靶點(diǎn)包括神經(jīng)發(fā)育障礙（UBE3A）、慢性疼痛（SCN9A）和肝病（PSCK9、HNF4a）（詳見表2中的參考文獻(xiàn)和詳細(xì)信息）。
表觀遺傳編輯技術(shù)的快速臨床轉(zhuǎn)化得益于CRISPR-Cas9基因組編輯平臺(tái)的成功，該平臺(tái)在短時(shí)間內(nèi)啟動(dòng)了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)。這些試驗(yàn)包括首次使用LNP制劑的mRNA進(jìn)行體內(nèi)直接給藥以治療轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性，并促成了首個(gè)CRISPR藥物Casgevy獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，該藥物通過編輯啟動(dòng)子DNA序列來上調(diào)胎兒血紅蛋白的表達(dá)。正在進(jìn)行的CRISPR-Cas9臨床試驗(yàn)的結(jié)果將解答與表觀遺傳編輯相關(guān)的重要問題，包括療效和毒性。此外，鑒于觀察到的染色體易位和其他與靶向DNA編輯相關(guān)的異常，優(yōu)化表觀遺傳編輯作為一種非侵入性基因表達(dá)調(diào)控方法的需求可能變得迫切。此外，過去二十年來使用鋅指核酸酶 (ZFNs) 或ZF ATFs的臨床試驗(yàn)樹立了安全性先例，其安全性可能優(yōu)于DNA嵌入型CRISPR平臺(tái)。事實(shí)上，一些表觀遺傳編輯公司正在利用ZFPs或TALEs（表 2）。
遞送
為了實(shí)現(xiàn)表觀遺傳編輯工具的體內(nèi)遞送，人們探索了多種方法（框5），包括腺相關(guān)病毒（AAV）和脂質(zhì)納米顆粒（LNP）。就CRISPR-Cas9編輯工具的遞送而言，AAV介導(dǎo)的遞送是臨床試驗(yàn)中最廣泛使用的方法，但其可能由病毒衣殼的免疫反應(yīng)引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)（包括死亡）顯然需要謹(jǐn)慎。例如，一名杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者在輸注高劑量表達(dá)dSaCas9-VP64的AAV9后死亡，死因是全身性先天免疫毒性，這種毒性可能由載體引起，但也可能與VP64的表達(dá)有關(guān)。此外，使用AAV遞送轉(zhuǎn)基因時(shí)，轉(zhuǎn)基因的長期表達(dá)可能會(huì)增加脫靶效應(yīng)；通過使用誘導(dǎo)系統(tǒng)（例如，缺氧反應(yīng)）或Cas9抑制劑，可以將表觀遺傳編輯的表達(dá)限制在特定的時(shí)間窗口內(nèi)，從而減輕這些影響。此外，轉(zhuǎn)基因的AAV大小限制（4.7 kb）阻礙了其在表觀遺傳編輯中的應(yīng)用，因?yàn)橥ǔＰ枰獙⑤^大的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與已經(jīng)很大的dCas9融合。目前正在探索旨在解決這一限制的方案，包括基于mRNA反式剪接重組的雙AAV載體技術(shù)和更小的Cas變體。最近，一項(xiàng)巧妙的研究通過遞送與未修飾的組蛋白H3尾部(H3K4me0)和非催化DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT3L)結(jié)構(gòu)域融合的鋅指蛋白(ZF)來募集內(nèi)源性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，從而規(guī)避了AAV載荷大小的限制。
表觀遺傳編輯工具體內(nèi)遞送的里程碑事件
2014年一痘病毒首次實(shí)現(xiàn)體內(nèi)表觀遺傳編輯。單純皰疹病毒(HSV)可通過短暫遞送鋅指蛋白(ZF)-G9a來抑制小鼠模型中的Fosb基因表達(dá)，從而展示了通過組蛋白甲基化實(shí)現(xiàn)強(qiáng)效位點(diǎn)特異性沉默的過程。?
2016年一胎內(nèi)電穿孔 在子宮內(nèi)對(duì)一種集成式 CRISPR-dCas9-SunTag-Tet1;Gfap 單向?qū)NA(sgRNA)進(jìn)行電穿孔處理后，當(dāng)將其遞送至胚胎發(fā)育第14.5天小鼠胚胎的側(cè)腦室時(shí)，能夠抑制 Gfap-GFP 報(bào)告基因的表達(dá)。這一應(yīng)用與發(fā)育障礙(如 Angelman 綜合征和脆性X染色體綜合征)中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制相關(guān)。
2016年一慢病毒 利用慢病毒載體將 CRISPR-dCas9-Tet1 遞送至表達(dá)一種對(duì)甲基化敏感的綠色熒光蛋白報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)。通過向皮膚真皮細(xì)胞和腦組織內(nèi)注射 CRISPR-dCas9-Tet1，綠色熒光蛋白的表達(dá)被激活。2018 年，這一方法被應(yīng)用于大腦中，以在小鼠脆弱X綜合征模型中解除 FMRP 的抑制狀態(tài)。?
2020年一水動(dòng)力尾靜脈注射 采用水動(dòng)力尾靜脈注射法，將一種全整合質(zhì)粒遞送CRISPR-dCas9-SunTag-Tet1;Fgf21-sgRNA，可短暫去甲基化并激活小鼠肝細(xì)胞中的Fgf21基因。?
2021年一細(xì)胞遞送 借助 ZF-KRAB 技術(shù)，該研究描述了一種頗具前景的平臺(tái)，可用于分泌構(gòu)建物(可輕松應(yīng)用于表觀遺傳編輯劑的遞送)。植入細(xì)胞表達(dá)基于 ZF 的人工轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)周圍組織中的基因表達(dá)。
2022年一脂質(zhì)納米顆粒 脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)封裝B4galnt2-sgRNA或用于dCas9-VP64、dCas9-p300、dCas9-VPH-SS18(VP64-D65-HSF1-SWI/SNF)的合成mRNA，能夠在活體條件下激活肝臟細(xì)胞中的B4galnt2基因。將sgRNA與dCas9合成mRNA分別進(jìn)行封裝，隨后注射混合LNPs制劑，這種方法所實(shí)現(xiàn)的肝臟遞送效率較使用混合dCas9合成mRNA和sgRNA的LNPs制劑提高了兩倍。?
2024年一外泌體(非病毒) 鼻內(nèi)遞送dCas9-DNMT3A核糖核蛋白靶向Bace1，減少阿爾茨海默病小鼠模型中的淀粉樣病理。?
2024年一自滅活型AAV 首次使用一種自動(dòng)靜默的阿諾-相關(guān)病毒(AAV)載體。此舉使得能夠短暫表達(dá)與未經(jīng)修飾的組蛋白H3尾巴(H3K4me0)相連的 ZFs 以及一個(gè)非催化性 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT3L)功能區(qū)(CHARM)。這一過程能夠招募內(nèi)源性 DNMT3A 來抑制 Prnp 在一種朊病毒疾病模型中的表達(dá)，從而降低長期編輯表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)并規(guī)避 AAV 載體的貨載量限制，適用于直接進(jìn)行表觀遺傳學(xué)編輯。?
2025年一重組蛋白遞送 針對(duì)六種 ZF 陣列或六種 CRISPR 實(shí)例所研發(fā)的重組蛋白表觀遺傳學(xué)編輯器“biologics”，能夠招募 DNA 去甲基化酶、TDG和Tet作用于Cxcl11。通過鼻內(nèi)和霧化給藥方式，這些制劑在小鼠肺上皮細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了Cxcl11的去甲基化和去抑制作用。?
2025年一LNPs: 臨床轉(zhuǎn)化 首次在靈長類動(dòng)物中展示了具有臨床實(shí)用價(jià)值的、持久的表觀遺傳編輯技術(shù)。Tremblay等借助LNPs遞送的基于dCas 的表觀遺傳編輯工具靶向PCSK9，在非人靈長類動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)了對(duì)低密度脂蛋白膽固醇的持久性降低，且表現(xiàn)出顯著的療效和可逆性。這代表著一項(xiàng)重大的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)里程碑。
重要研究發(fā)現(xiàn)，某些腺相關(guān)病毒（AAV）能夠有效地將Cas9工具遞送至多種物種，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)化研究。而諸如一體化自滅活A(yù)AV載體等改進(jìn)方案的出現(xiàn)，無疑將推動(dòng)該領(lǐng)域的發(fā)展。與此同時(shí)，其他遞送平臺(tái)也正在被探索，例如慢病毒，其有效載荷更大（約8?10 kb），并可實(shí)現(xiàn)組織特異性一體化遞送。此外，其他非病毒遞送方法也在研究中，包括工程細(xì)胞、支架、病毒樣顆粒和重組蛋白。
繼LNP介導(dǎo)的mRNA遞送成功應(yīng)用于嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)疫苗之后，利用LNP遞送RNA的方法受到了廣泛關(guān)注，并正在臨床試驗(yàn)中探索其在基因組編輯方面的應(yīng)用。該方法已被證明可有效遞送表觀遺傳編輯工具。并用于OTX?2002的臨床研究（NCT05497453）。其他配方，例如使用兩種不同的LNP配方（編碼dCas9融合蛋白的mRNA與sgRNA），以防止引導(dǎo)RNA優(yōu)先于mRNA被包裹，可能進(jìn)一步提高療效。此外，引入靶向配體以誘導(dǎo)LNP在目標(biāo)組織中的攝取也有助于提高特異性，其低免疫原性使得CRISPR?Cas9可以重復(fù)給藥而不會(huì)引起免疫問題。此外，在sgRNA遞送方面，人們正在研究各種方法來增強(qiáng)其穩(wěn)定性、分布和細(xì)胞攝取，包括化學(xué)修飾和使用化學(xué)穩(wěn)定的保護(hù)性寡核苷酸。
結(jié)論與展望
繼2003年首次報(bào)道直接內(nèi)源性表觀遺傳編輯調(diào)控基因表達(dá)之后，十年間后續(xù)研究陸續(xù)發(fā)表。近幾年，該領(lǐng)域取得了顯著進(jìn)展，研究表明表觀遺傳編輯具有靶向特異性、高效性、情境依賴性、可持續(xù)性和臨床前治療效果。此外，表觀遺傳編輯已成為一種強(qiáng)大的“即用即?！辈呗?，可在不改變基因組序列的情況下實(shí)現(xiàn)多重雙向表達(dá)調(diào)控。盡管取得了這些進(jìn)展，我們也認(rèn)識(shí)到因果關(guān)系的規(guī)律并非總是簡單的，并且我們開始逐漸理解其可持續(xù)性的規(guī)則。除了加深對(duì)表觀遺傳重編程規(guī)則的理解和改進(jìn)遞送方式外，識(shí)別預(yù)測(cè)患者對(duì)表觀遺傳編輯反應(yīng)的生物標(biāo)志物對(duì)于確保有效的臨床試驗(yàn)可能至關(guān)重要。除了這些基本考量之外，進(jìn)一步普及CRISPR技術(shù)及其表觀遺傳學(xué)的倫理意義對(duì)于該技術(shù)的進(jìn)步至關(guān)重要。盡管表觀遺傳編輯被認(rèn)為比DNA序列編輯侵入性更小，且可能更容易逆轉(zhuǎn)，但兩者都對(duì)人類健康和進(jìn)化構(gòu)成潛在?險(xiǎn)。與基因序列編輯相比，由于胚胎發(fā)生過程中的擦除波和表觀遺傳重編程，表觀遺傳編輯的遺傳性要低得多。盡管在小鼠中已證實(shí)基因靶向甲基化及其相關(guān)表型可以跨代遺傳，但這可能與實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的DNA瘢痕有關(guān)。對(duì)表觀遺傳編輯技術(shù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)負(fù)責(zé)的創(chuàng)新，應(yīng)能確保這種強(qiáng)大而用途廣泛的新型治療方法的安全應(yīng)用。
Heller, E.A., Bintu, L. & Rots, M.G. Epigenetic editing: from concept to clinic.?Nat Rev Drug Discov?(2025). https://doi.org/10.1038/s41573-025-01323-0
