hello，新年過完了，大家相親成功了沒？？成功了的留個言，恭喜一下你~~~~， 反正我是失敗了~~~~??，好了，新的一年又要開始了，新的征程等著我們，單細(xì)胞空間的研究永遠(yuǎn)在路上，今天給大家分享的文獻(xiàn)在Single cell transcriptomic and spatial landscapes of the developing human pancreas，無論遇到什么，一定要相信自己，只是運(yùn)氣不好，絕不是自己才華不夠。

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• endocrine (INS, GCG, SST, PAX6)
• acinar (CPA1, PRSS1, CLPS)
• ductal (SLC4A4, CFTR, ANXA4)
• mesenchymal (COL3A1, DCN, VIM)
• immune (RAC2, LYZ, TRAC)
• endothelial (VWF, ADGRL4, ANGPT2)
• Schwann (CRYAB, CDH19, SOX10)
• erythroblasts (HBB, HBG2, HBA1)

最為關(guān)鍵的地方，細(xì)胞的空間共定位與臨近通訊、空間“單元”分析

ABSTRACT

在干細(xì)胞定向分化方面取得的進(jìn)展表明，了解人類胰腺發(fā)育可以為無限量的產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞用于糖尿病移植治療提供線索。然而，目前的分化方案未能成功地在體外重復(fù)生成功能性人類 β 細(xì)胞，部分原因是對人類胰腺發(fā)育的不完全了解。在這里，對發(fā)育中的人類胰腺的各種細(xì)胞類型進(jìn)行了詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄組分析，包括它們的空間基因模式。在多個發(fā)育時間點(diǎn)將單細(xì)胞 RNA 測序與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，并揭示了發(fā)育中的人類胰腺中不同的時空基因級聯(lián)。細(xì)胞軌跡推斷確定了內(nèi)分泌祖細(xì)胞群和新的分支特異性基因，因?yàn)樽婕?xì)胞向 α 或 β 細(xì)胞分化，表明轉(zhuǎn)錄成熟發(fā)生在這個發(fā)育時間范圍內(nèi)?？臻g分化軌跡表明，未成熟的Schwann細(xì)胞在空間上與內(nèi)分泌祖細(xì)胞位于同一位置，并通過 L1CAM-EPHB2 通路促進(jìn) β 細(xì)胞成熟。綜合分析方法使我們能夠識別間充質(zhì)內(nèi)的異質(zhì)性和多譜系動態(tài)，表明它有助于外分泌腺泡細(xì)胞狀態(tài)。

INTRODUCTION

胰腺是由外分泌和內(nèi)分泌組成的多細(xì)胞器官。 外分泌胰腺包含分泌消化液的腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞，而內(nèi)分泌胰腺包含協(xié)同調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)的α、β、δ、ε和胰多肽細(xì)胞。 盡管胰腺在營養(yǎng)消化和葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其功能障礙導(dǎo)致胰腺炎、胰腺癌和糖尿病影響全球超過 50 億人，但人類個體細(xì)胞類型如何發(fā)育的潛在機(jī)制仍不清楚。

了解胰腺的發(fā)育軌跡可以為產(chǎn)生無限量的胰島素的 β 細(xì)胞提供必要的知識，例如，從干細(xì)胞用于 1 型糖尿病的細(xì)胞替代療法，并且近年來已經(jīng)開展了大量工作來定義有效的分化方案。然而，目前的分化策略主要基于在小鼠胰腺發(fā)育中鑒定的基因級聯(lián)反應(yīng)，不能在體外重復(fù)產(chǎn)生功能齊全的人類β細(xì)胞。這并不奇怪，因?yàn)槿祟愐葝u發(fā)育的時間跨度比小鼠長，并且已經(jīng)報(bào)道了種間差異，例如在胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，并且存在內(nèi)分泌分化和關(guān)鍵分化的延遲表達(dá)人類的基因。因此，需要對人類胰腺內(nèi)分泌發(fā)生有更清晰的了解，最近通過單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 在這方面取得了一些進(jìn)展。因此，已經(jīng)在胰腺發(fā)育的早期階段（受孕后第 7 周和第 10 周；PCW）鑒定了不同的祖細(xì)胞群，并且最近鑒定了發(fā)育中的小鼠和人類胰腺之間譜系分化的顯著差異。

然而，雖然 scRNA-seq 以前所未有的規(guī)模提供了基因表達(dá)譜的snapshot，但與空間細(xì)胞背景相關(guān)的基因信息丟失了，因?yàn)樾枰M織解離?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)給出了位置基因模式，并提供了組織環(huán)境中細(xì)胞的空間屬性。因此，在本研究中，利用了人類胎兒胰腺在多個發(fā)育階段的高通量 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，然后通過數(shù)據(jù)整合來定義人類胰腺發(fā)育的細(xì)胞異質(zhì)性和空間發(fā)育landscope。這種方法使我們能夠表征和空間解析處于不同發(fā)育階段的多個人類胰腺細(xì)胞群，包括它們的細(xì)胞間相互作用，并且已經(jīng)確定了調(diào)節(jié)祖細(xì)胞分化的新基因候選者。

By estimating pairwise similarity in transcriptional profiles among cells, we have uncovered spatial differentiation trajectories in situ, which enabled us to identify, for the first time, the importance of Schwann cells and mesenchymal cells in the differentiation of human endocrine progenitors and acinar cells, respectively（首次確定了Schwann細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞分別在人類內(nèi)分泌祖細(xì)胞和腺泡細(xì)胞分化中的重要性 ）.

RESULTS

scRNA-seq analysis of whole human pancreases at 12-20 PCW

將 scRNA-seq 與 10x Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合，系統(tǒng)地描述了人類胰腺的發(fā)育landscope。對于 scRNA-seq，跨越 7 個發(fā)育時間點(diǎn)（12、13、14、15、18、19 和 20 個 PCW）的 12 個個體胚胎的整個胰腺被解離，活分選的單細(xì)胞與結(jié)合到普遍存在的表面標(biāo)志物 b2M 和 CD298，它們由發(fā)育中的人類胰腺表達(dá)。使用 10x Chromium protocol對細(xì)胞進(jìn)行測序，并在嚴(yán)格過濾后保留 24,080 個高質(zhì)量細(xì)胞用于下游分析（12pcw：4099、13pcw：7168、14pcw：3530、15pcw：1664、18pcw：2171、19pcw：3827、20pcw：1621）. scRNA-seq 數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚類揭示了不同的腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成紅細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和Schwann細(xì)胞群，which we identified by differential expression of established markers.。例如，通過 CPA1 的表達(dá)鑒定腺泡細(xì)胞，通過 CHGA 鑒定內(nèi)分泌細(xì)胞，通過 COL3A1 鑒定間充質(zhì)，通過 RAC2 鑒定免疫細(xì)胞，通過 CFTR 鑒定導(dǎo)管細(xì)胞，通過 ADGRL4 鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，通過 HBB 鑒定紅細(xì)胞，通過 CRYAB 表達(dá)鑒定Schwann細(xì)胞clusters(細(xì)胞定義的marker還是需要總結(jié)一下)。

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Spatial map of the developing human pancreas

scRNA-seq 分析顯示，在妊娠中期早期，發(fā)育中的人類胰腺內(nèi)存在多種胰腺細(xì)胞類型。為了對它們進(jìn)行空間定位并在其形態(tài)背景下分析細(xì)胞的基因表達(dá)動態(tài)，使用彼此相距約 100μm 的復(fù)制組織切片對在 12、15、18 和 20 PCW 檢索的 8 個胰腺切片進(jìn)行 10x Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué).我們將樣本測序到 177.5 x 10⁶讀數(shù)的中值深度（四分位距 116.9-294.4 x 10⁶），每個spot平均產(chǎn)生 1692 個基因和每個spot 3395 個唯一分子標(biāo)識符 (UMI)。 Seurat 基因表達(dá)特征的預(yù)處理和分析揭示了 3-9 個細(xì)胞clusters（3 clusters at 12 PCW, 8 clusters at 15 PCW and 9 clusters each at 18 and 20 PCW），它們與組織內(nèi)的不同空間位置相關(guān)。使用標(biāo)記基因的注釋表明，一些clusters包含多個細(xì)胞，正如使用 10x Visium 時可用的 ~55μm 空間分辨率所預(yù)期的那樣。使用這種方法，能夠?qū)?nèi)分泌細(xì)胞群（顯示胰島激素 GHRL、SST 和 GCG 的高表達(dá)）、胰腺/內(nèi)分泌祖細(xì)胞（表達(dá) NKX6-1、SOX9 和 HES1）、內(nèi)皮細(xì)胞（表達(dá) VWF 和 ANGPT2）、導(dǎo)管/腺泡（表達(dá) CFTR 和 HES6）、腺泡（表達(dá) HES6）和間充質(zhì)細(xì)胞（表達(dá) COL3A1 和 VIM）進(jìn)行分層。然后，在 18PCW 確定了空間鄰近細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)空間鄰域由腺泡和內(nèi)分泌細(xì)胞、內(nèi)分泌、導(dǎo)管、腺泡和胰腺祖細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞共享，這表明這些相鄰細(xì)胞群更有可能一起相互作用。將相同或不同細(xì)胞類型的細(xì)胞之間的相互作用分別表示為同型或異型。間充質(zhì)-間充質(zhì)對的細(xì)胞接近度得分最高，表明細(xì)胞間相互作用高度豐富，而內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)計(jì)優(yōu)先擁有最多數(shù)量的同型相互作用。空間鄰近分析還表明，內(nèi)分泌細(xì)胞和胰腺祖細(xì)胞之間發(fā)生了最高的異型相互作用，預(yù)測導(dǎo)管/腺泡細(xì)胞和胰腺祖細(xì)胞之間以及腺泡細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞之間也存在大量相互作用。通過在 Giotto（關(guān)于Giotto，大家可以參考我的文章10X空間轉(zhuǎn)錄組分析回顧之Giotto） 實(shí)施的 Delaunay 三角測量連接相鄰細(xì)胞，在不同細(xì)胞類型之間創(chuàng)建了空間網(wǎng)絡(luò)，將中心區(qū)域定義為表達(dá)相同基因的相鄰細(xì)胞數(shù)量最多的區(qū)域。這使我們能夠識別驅(qū)動整個胰腺空間趨勢的空間可變基因，這些基因與 15PCW 的不同中心區(qū)域相關(guān)，隨著胰腺的擴(kuò)張和細(xì)胞的混合，這些基因在 20PCW 時變得不那么突出。因此，在 15 PCW 時可以看出，編碼腺泡蛋白脂肪酶的 CLPS 和 INS 的表達(dá)共定位，indicating that at this stage of development the exocrine and endocrine pancreas are not yet defined by the distinct anatomy that is observed post-natally。然而，到 20 PCW 時，腺泡和內(nèi)分泌細(xì)胞在空間上是分開的，并且表達(dá) INS 的細(xì)胞的離散clusters很明顯，這很可能反映了胰腺內(nèi)散布的胰島的存在。鑒定的大多數(shù)空間相關(guān)基因是內(nèi)分泌（INS、GCG、PCSK1N）、間充質(zhì)（COL1A1、COL3A1）和腺泡細(xì)胞群（CEL、CPA1）的既定標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記，但也鑒定了其他新的空間相關(guān)基因.例如，?；o酶A硫酯酶 7 (ACOT7) 和 ATP1A1 與Schwann cell populations、DCN、ADAM33 和 COX6A1 與間充質(zhì)和 ACTA2 與內(nèi)皮細(xì)胞在空間上相關(guān)。

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Cell type deconvolution of the spatially resolved developing human pancreas transcriptome（單細(xì)胞空間聯(lián)合）

雖然空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析提供了人類胰腺在不同發(fā)育階段的細(xì)胞間接近度的新信息，但 10x Visium 轉(zhuǎn)錄組學(xué)的 55μm 光斑直徑不允許單細(xì)胞分辨率。因此，將 10x Visium 數(shù)據(jù)與 scRNA-seq 數(shù)據(jù)相結(jié)合，以表征每個空間體素處發(fā)育中的人類胰腺細(xì)胞類型，這種方法最近已用于繪制人類子宮內(nèi)膜和發(fā)育中的雞心臟圖。首先使用正則化負(fù)二項(xiàng)式回歸將scRNA-seq 數(shù)據(jù)與最近發(fā)布的關(guān)于 8-19 WPC 發(fā)育中的人類胰腺的數(shù)據(jù)集相結(jié)合，以提高時間分辨率。為了區(qū)分這兩個數(shù)據(jù)集，將集成數(shù)據(jù)稱為“組合 scRNA-seq”。在過濾和質(zhì)量控制之后，保留了 8 到 20 個 PCW 的 53,204 個細(xì)胞。分析發(fā)現(xiàn)兩個數(shù)據(jù)集之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（r=0.8），并且結(jié)合數(shù)據(jù)能夠識別已經(jīng)在 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中找到的clusters，但分辨率有所提高。通過將組合的 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)投影到一個共同的潛在空間中，對 10x Visium 樣本的每個空間spot的細(xì)胞類型組成進(jìn)行反卷積，然后通過典型相關(guān)分析（CCA）識別出具有足夠鄰域的錨細(xì)胞（anchor cells）。這允許將 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的細(xì)胞注釋轉(zhuǎn)移到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，從而原位識別 α、β、δ、內(nèi)分泌祖細(xì)胞、腺泡、導(dǎo)管、內(nèi)皮細(xì)胞、Schwann細(xì)胞、免疫細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。

We then incorporated the cell type predictions into a deep-learning based method to visualise the cell composition within each spatial voxel and predict cell proportions at each stage of development（將細(xì)胞類型預(yù)測納入基于深度學(xué)習(xí)的方法中，以可視化每個空間spot內(nèi)的細(xì)胞組成并預(yù)測每個發(fā)育階段的細(xì)胞比例）。正如預(yù)期的那樣，發(fā)現(xiàn)隨著胰腺的發(fā)育上皮細(xì)胞的擴(kuò)張（例如，與 12 PCW 相比，20 PCW 時腺泡細(xì)胞增加了 175%），并且間充質(zhì)細(xì)胞的比例相應(yīng)減少。間充質(zhì)細(xì)胞多位于胰腺外周，12 PCW時大部分細(xì)胞類型存在于樞紐區(qū)，15 PCW時更為突出。例如，在 15 PCW 時，腺泡、免疫、間充質(zhì)、內(nèi)分泌/內(nèi)分泌祖細(xì)胞和Schwann細(xì)胞的不同區(qū)域很明顯，而到 20 PCW 時，細(xì)胞分布在整個胰腺中，其中大部分是腺泡。在內(nèi)分泌細(xì)胞中，在 12 PCW 時，α 細(xì)胞的豐度是 β 細(xì)胞的兩倍多，但在 15、18 和 20 PCW 時，這兩種細(xì)胞類型的比例相當(dāng)。由于成人胰島含有約 55% 的 β 細(xì)胞和約 38% 的 α 細(xì)胞，因此隨著妊娠期超過 20 PCW，β 細(xì)胞數(shù)量可能會進(jìn)一步增加。在我們query的所有發(fā)育階段，免疫細(xì)胞在空間上與間充質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞共存，但與內(nèi)分泌細(xì)胞不共存，而Schwann細(xì)胞在 15 PCW 時與間充質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)分泌祖細(xì)胞在空間上非常接近。

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Lineage dynamics within the endocrine compartment

在 scRNA-seq 和 ST 數(shù)據(jù)集中確定了各種細(xì)胞類型后，接下來專注于內(nèi)分泌細(xì)胞的基因表達(dá)軌跡分析。重新聚類 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的內(nèi)分泌細(xì)胞識別出 12 個subclusters，并使用差異表達(dá)基因和典型標(biāo)記，識別出 3 個內(nèi)分泌祖細(xì)胞群 (NEUROG3+)、4 個 β 細(xì)胞群 (INS+)、2 個 delta 細(xì)胞群 (SST+) ，以及每個用于 α (GCG+，對 PPY 細(xì)胞也呈陽性) 和 epsilon (GHRL+) 細(xì)胞的clusters。三個內(nèi)分泌祖細(xì)胞 (EP) clusters根據(jù)它們的基因表達(dá)進(jìn)行區(qū)分：將具有非常高 NEUROG3 表達(dá)的那些表示為 NEUROG3^hi，那些具有低 NEUROG3 和低胰島素表達(dá)的表示為 NEUROG3^low/INS^low，提示細(xì)胞向 β 細(xì)胞過渡，以及幾種胰島激素表達(dá)非常低的多激素（INS^low/GCG^low/SST^low/GHRL^low）。然后，試圖使用時間序列軌跡分析來確定內(nèi)分泌祖細(xì)胞亞群之間的譜系關(guān)系，這表明三個 EP 種群在推斷的發(fā)育時間尺度中較早發(fā)現(xiàn)，并且如預(yù)期的那樣主要來自 12 和 13 PCW。軌跡分析還預(yù)測，NEUROG3^hi clusters中的細(xì)胞注定要過渡到包含相等比例的早期（12 和 13 PCW）和晚期 β 細(xì)胞（18 PCW）的 β 細(xì)胞clusters之一，而晚期 β和 delta 細(xì)胞 (18-20PCW) 和中期 α 細(xì)胞 (14 和 15 PCW) 預(yù)計(jì)會從 NEUROG3^low/INS^low EP 群體中分化。晚期β細(xì)胞顯示成熟標(biāo)志物MAFA和UNC3的表達(dá)增加。一些 epsilon 細(xì)胞在過渡到 beta 或 delta 細(xì)胞時沿著 NEUROG3^low/INS^low EP 軌跡聚集在一個中間clusters內(nèi)，這可能表明 epsilon 細(xì)胞在發(fā)育中的多能性。然后，使用 Monocle 3 偽時間分析來研究是否可以概括使用時間序列軌跡方法做出的軌跡預(yù)測. Monocle 3 鑒定了一個具有低 NEUROG3 和低 INS 表達(dá)的 EP population，類似于 NEUROG3^low/INS^low EP，并且該群體中的細(xì)胞也具有低 GCG 表達(dá)。這些細(xì)胞還表達(dá)了已知參與胰腺內(nèi)分泌發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，例如 NEUROD1、胰島素基因增強(qiáng)蛋白 ISL1 和 PAX6。此外，還鑒定了與其他組織發(fā)育有關(guān)的基因，例如胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白樣 1 (IGFPBL1)、胸腺肽原 (PTMA) 和 G 蛋白亞基 γ 8 (GNG8)。 Monocle分析表明，EP細(xì)胞后來分裂成兩個分支，第一個分支屬于β細(xì)胞譜系，而第二個分支包含α和β細(xì)胞。研究了 NEUROG3^low/INS^low EP 細(xì)胞分化為 α 或 β 細(xì)胞譜系時的分支依賴性基因表達(dá)，并確定了除已建立標(biāo)記外的新分支特異性基因，表明轉(zhuǎn)錄成熟發(fā)生在此發(fā)育時間范圍內(nèi)。為了確定在原位是否存在類似的內(nèi)分泌祖細(xì)胞軌跡，分析確定了在 20 PCW 時 NEUROG3 和 INS 均呈陽性的細(xì)胞，并進(jìn)行了空間軌跡推斷。這使我們能夠探索內(nèi)分泌細(xì)胞的進(jìn)展，并且我們確定了沿空間軌跡上調(diào)或下調(diào)的基因。已知的內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記基因，如嗜鉻粒蛋白 A 和 B (CHGA, CHGB)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白 (TTR)、胰高血糖素 (GCG)、生長抑素 (SST)、胰島素 (INS) 和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 1 型抑制劑 (PCSK1N)與空間軌跡呈正相關(guān)，而胰腺祖細(xì)胞表面標(biāo)記糖蛋白 2 (GP2) 和腺泡相關(guān)基因 SPINK1、CLPS、CPA1 和 PRSS1 被下調(diào)，表明祖細(xì)胞向更終末分化的內(nèi)分泌狀態(tài)轉(zhuǎn)變。

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Role of Schwann cells in endocrine cell development

在檢查了內(nèi)分泌clusters內(nèi)的譜系動態(tài)之后，接下來研究了非內(nèi)分泌細(xì)胞對內(nèi)分泌規(guī)范的貢獻(xiàn)。分析專注于 Schwan細(xì)胞，因?yàn)?strong>它們在空間上與 15 PCW 的內(nèi)分泌祖細(xì)胞位于同一位置，這表明這些細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊可能有助于內(nèi)分泌細(xì)胞分化。 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中確定了五個亞群，它們都表達(dá)了 Schwan細(xì)胞標(biāo)記 CRYAB。根據(jù)干細(xì)胞標(biāo)記物 SOX2 和鈣粘蛋白 19 (CDH19) 的表達(dá)將clusters 0、1 和 4 注釋為 Schwan細(xì)胞前體 (SCP)，而cluster 3 被定義為未成熟 Schwan細(xì)胞 (iSC) 群，因?yàn)樗禺愋员磉_(dá) GAP43。cluster 2 表達(dá)編碼髓鞘蛋白零 (MPZ) 和蛋白脂質(zhì)蛋白 1 (PLP1) 的基因，cluster 2 的基因本體分析確定這些細(xì)胞與髓鞘形成和軸突發(fā)育有關(guān)，因此它們被命名為髓鞘 Schwan細(xì)胞 (mSC) 。

鑒于在人類胰腺發(fā)育過程中Schwan細(xì)胞與內(nèi)分泌祖細(xì)胞非常接近，因此研究了 scRNA-seq 數(shù)據(jù)中的細(xì)胞-細(xì)胞連接性，以確定可能參與這些群體之間旁分泌信號傳導(dǎo)的配體-受體對（空間臨近通訊）。確定了細(xì)胞和內(nèi)分泌祖細(xì)胞之間的多個配體-受體對，并專注于 L1 細(xì)胞粘附分子 (L1CAM)-ephrin B2 (EPHB2) 相互作用，因?yàn)?L1CAM 是最高度預(yù)測的配體，其表達(dá)對Schwan細(xì)胞具有特異性。僅限于 iSC 群體，而 EPHB2 由內(nèi)分泌祖細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞表達(dá)。將 L1CAM-EPHB2 的表達(dá)映射到在 15 PCW 的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，并確定 L1CAM-EPHB2 相互作用的局部熱點(diǎn)發(fā)生在Schwan細(xì)胞和內(nèi)分泌祖細(xì)胞之間的界面處。這些觀察結(jié)果與Schwan細(xì)胞在空間上與內(nèi)分泌祖細(xì)胞位于同一位置并通過 L1CAM-EPHB2 通路促進(jìn) β 細(xì)胞成熟一致。

還使用了基于分區(qū)的圖抽象 (PAGA)，它顯示了基于細(xì)胞clusters之間基因表達(dá)的無偏譜系關(guān)系，以研究Schwan細(xì)胞和內(nèi)分泌祖細(xì)胞是否共享譜系關(guān)系。該分析表明，cluster 3 Schwann 細(xì)胞與cluster 9 內(nèi)分泌細(xì)胞共享連接邊緣，包含內(nèi)分泌祖細(xì)胞、β 和 δ 細(xì)胞，并且這些細(xì)胞群在 15 PCW 的降維空間內(nèi)彼此接近。正如所料，擴(kuò)散偽時間圖表明Schwan細(xì)胞在所有cluster中轉(zhuǎn)錄較早，因此將它們設(shè)置為軌跡的root。然后，我們對Schwann細(xì)胞cluster進(jìn)行空間軌跡推斷，并觀察到內(nèi)分泌細(xì)胞被放置在Schwann細(xì)胞軌跡的另一端，沿著軌跡上調(diào)（藍(lán)色）或下調(diào)（紅色）的過渡標(biāo)記。對上調(diào)的過渡標(biāo)記進(jìn)行基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)參與內(nèi)分泌規(guī)范的轉(zhuǎn)錄因子如 RFX6、PAX6、PDX1、ISL1 和 NKX2-2 顯著富集（p<0.0001）。富含在基因組中被下調(diào)或與軌跡負(fù)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（即在Schwann細(xì)胞中表達(dá)高而在內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)低的基因）包括參與干性的 SOX2 和神經(jīng)元命運(yùn)基因 POU3F1，這表明細(xì)胞沿Schwann內(nèi)分泌軌跡可能會失去其干性和神經(jīng)元commitment。在 20 PCW 時，與 15 PCW 相比，內(nèi)分泌細(xì)胞的終末分化程度更高，Schwann細(xì)胞不再與內(nèi)分泌祖細(xì)胞或其他內(nèi)分泌細(xì)胞在空間上共定位。

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Mesenchymal heterogeneity in the developing human pancreas

盡管間充質(zhì)在小鼠胰腺器官發(fā)生中發(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)和生化作用，但對發(fā)育中的人類胰腺中的間充質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性知之甚少。因此，重新分類了間充質(zhì)（10834 個細(xì)胞）并確定了 17 個轉(zhuǎn)錄不同的亞群，所有這些亞群都表達(dá)了間充質(zhì)基因 COL1A1、COL3A1 和 VIM。根據(jù)已知標(biāo)記基因的表達(dá)對clusters進(jìn)行注釋。因此，基于 Wilms 腫瘤基因 WT1 和 IGFBP2 的表達(dá)，clusters 0、1、2 和 4 被指定為間皮細(xì)胞；clusters 12 和 15 是血管平滑肌 (VSM) 細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá) α 平滑肌肌動蛋白 ACTA2 和轉(zhuǎn)凝膠蛋白 TAGLN；cluster 13 是由 STMN1 和 MKi67 的強(qiáng)表達(dá)所定義的增殖性間充質(zhì)；而cluster 14 屬于基于 HBB 表達(dá)的造血譜系。cluster 4 對成骨標(biāo)志物 CLEC11A 也呈陽性，它很可能從間皮細(xì)胞分化而來 。

發(fā)現(xiàn)cluster 11 富含腺泡基因 colipase (CLPS) 和絲氨酸蛋白酶抑制劑 Kazal 型 1 (SPINK1)。鑒于 CLPS 和 SPINK1 在該間充質(zhì)cluster中的共表達(dá)，假設(shè)間充質(zhì)與腺泡成熟之間存在關(guān)聯(lián)。時間序列軌跡分析表明，表達(dá) IGFBP2 的cluster 1 間皮細(xì)胞代表了該譜系中的早期細(xì)胞狀態(tài)，主要由 12 和 13 PCW 的細(xì)胞組成，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá) ACTA2 的 15 cluster VSM 細(xì)胞。這與間皮細(xì)胞是 VSM 的成熟前體是一致的，并且它們也被認(rèn)為有助于小鼠胰腺中的 VSM 譜系。cluster 8 和 10 強(qiáng)烈表達(dá)泛間充質(zhì)標(biāo)記 COL3A1，預(yù)計(jì)它們將分化成多個譜系，包括cluster 12 VSM、cluster 14 造血細(xì)胞、cluster 4 成骨前體和表達(dá)亞精胺的cluster 5 細(xì)胞。該分析將表達(dá) CLPS 和 SPINK1 的簇置于軌跡的出口，表明間充質(zhì)和腺泡細(xì)胞群之間可能存在譜系關(guān)系。因此，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)原位研究了間充質(zhì)細(xì)胞和腺泡細(xì)胞之間的譜系動力學(xué)。這表明在 18 和 20 PCW 間充質(zhì)細(xì)胞主要位于胰腺外周，并且通常與內(nèi)皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞相關(guān)，而腺泡細(xì)胞與其相鄰。空間軌跡分析預(yù)測在 18 PCW 和 20 PCW 時間充質(zhì)細(xì)胞向腺泡細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。我們確定了沿空間軌跡分別從間充質(zhì)進(jìn)化枝 9、20 和 66 到腺泡進(jìn)化枝 8、17、2 和 67 上調(diào)的過渡基因。上調(diào)過渡基因的富集分析 (Kuleshov et al., 2016) 顯示參與 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號、平面細(xì)胞極性和腺上皮細(xì)胞發(fā)育的基因顯著富集，表明涉及腺泡細(xì)胞發(fā)育和生長的過程。我們在 20 PCW 的基于軌跡的差異基因表達(dá)分析還發(fā)現(xiàn)，包括 COL3A1、COL1A2 和 MGP 在內(nèi)的間充質(zhì)基因被下調(diào)，而腺泡基因 CPA1 和 CEL 的表達(dá)增加。

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Discussion

在關(guān)鍵時間窗口不同細(xì)胞之間的協(xié)調(diào)相互作用對于器官發(fā)生至關(guān)重要，但我們對不同人類胰腺細(xì)胞類型在發(fā)育過程中如何相互作用的理解是有限的。使用 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，在妊娠 12-20 周時鑒定并定位了人類胎兒胰腺中的內(nèi)分泌細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、雪旺細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞類型。為了提高我們的 scRNA-seq 的時間分辨率，我們將其與最近發(fā)布的關(guān)于發(fā)育中的人類胰腺的數(shù)據(jù)集集成，并使用組合數(shù)據(jù)對我們的 10x Visium 樣本中的細(xì)胞類型進(jìn)行去卷積。我們的數(shù)據(jù)揭示了不同比例的胰腺細(xì)胞類型，間充質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量隨著發(fā)育時間的推移而減少，同時上皮細(xì)胞數(shù)量也相應(yīng)增加。我們發(fā)現(xiàn)了內(nèi)分泌、Schwann和間充質(zhì)隔間內(nèi)的異質(zhì)性，以及亞群之間的預(yù)測譜系關(guān)系。我們研究的主要優(yōu)勢是胎兒胰腺在 12-20 PCW 相對較寬的發(fā)育范圍內(nèi)的可用性，以及我們在這個時間過程中結(jié)合 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)。這使我們第一次能夠重建原位發(fā)生的發(fā)育軌跡，并分別描繪間充質(zhì)和雪旺細(xì)胞在分化為腺泡和內(nèi)分泌譜系中的貢獻(xiàn)。

有人提出，神經(jīng)嵴細(xì)胞（Schwann細(xì)胞的前體）在小鼠中直接分化為胰島細(xì)胞，但缺乏Schwann細(xì)胞祖細(xì)胞的大鼠不會發(fā)育出內(nèi)分泌胰腺。 盡管如此，Schwann細(xì)胞前體在胰腺發(fā)育中的可塑性尚未得到充分認(rèn)識，并且它們與其他組織中的細(xì)胞規(guī)格有關(guān)。 我們在這里展示了Schwann細(xì)胞亞群，即未成熟Schwann細(xì)胞，表達(dá) L1CAM 并位于內(nèi)分泌祖細(xì)胞的空間附近，具有 L1CAM-EPHB2 相互作用的局部熱點(diǎn)。 因此，提出胰腺未成熟的Schwann細(xì)胞通過 L1CAM-EPHB2 信號傳導(dǎo)促進(jìn)內(nèi)分泌祖細(xì)胞的成熟，這可能對改善 β 細(xì)胞質(zhì)量很重要，因?yàn)橐炎C明神經(jīng)嵴細(xì)胞/β 細(xì)胞共移植可增加 β 細(xì)胞增殖并改善糖尿病小鼠的血糖正常.

我們還發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)內(nèi)被低估的異質(zhì)性，這讓人聯(lián)想到小鼠胰腺間充質(zhì)的多樣性。 值得注意的是，我們在間充質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了一個腺泡cluster，它位于泛間充質(zhì) COL3A1+ cluster的軌跡末端。 從我們的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中原位預(yù)測了類似的間充質(zhì)-腺泡軌跡，我們發(fā)現(xiàn)了與腺泡細(xì)胞分化相關(guān)的基因本體的顯著富集，例如經(jīng)典 Wnt-β-連環(huán)蛋白信號的正調(diào)控、平面細(xì)胞極性和腺上皮細(xì)胞發(fā)展。 這表明間充質(zhì)在發(fā)育中的人類胰腺中腺泡細(xì)胞的適當(dāng)分化中的重要性，這與先前的研究一致，即在沒有胰腺間充質(zhì)的情況下小鼠外分泌胰腺未能發(fā)育。

In summary, we have characterised and spatially resolved multiple human pancreatic cell populations at multiple developmental stages. We have identified sub-populations of human endocrine progenitors, novel genes that may direct their differentiation to beta or alpha cell lineage, and the influence of pancreas microenvironment on endocrine progenitor differentiation. Our data also identified the roles of Schwann precursor cells and mesenchymal cells in the differentiation of endocrine progenitors and acinar cells, respectively.

Method（關(guān)注重點(diǎn)的方法）

10x scRNA-seq data analysis

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Integration of scRNA-seq data with previously published 10x Chromium data（單細(xì)胞空間聯(lián)合，還是Seurat）

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Spatial transcriptomics deconvolution and visualisation

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Spatial co-localisation of receptor-ligand pairs（重點(diǎn)）

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空間網(wǎng)絡(luò)

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生活很好，有你更好