ATAC-seq
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing）是利用轉(zhuǎn)座酶研究染色質(zhì)可及性的高通量測序技術(shù)。
染色質(zhì)可及性
首先介紹一下什么是染色質(zhì)可及性。正常情況下，DNA與核小體纏繞折疊在一起形成染色質(zhì)，但是DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄都需要將染色體的高級結(jié)構(gòu)解開，然而解開并不需要打開全部染色體，只需要打開表達(dá)基因的區(qū)域，這部分打開的染色質(zhì)，就叫開放染色質(zhì)（open chromatin）。而染色質(zhì)一旦打開，就允許一些調(diào)控蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子和輔因子）跑過來與之相結(jié)合。而染色質(zhì)的這種特性，就叫做染色質(zhì)的可及性（chromatin accessibility）。
ATAC-seq原理
DNA轉(zhuǎn)座，是一種把DNA序列從染色體的一個區(qū)域搬運(yùn)到另外一個區(qū)域的現(xiàn)象，由DNA轉(zhuǎn)座酶來實(shí)現(xiàn)。這種轉(zhuǎn)座插入DNA，需要插入位點(diǎn)的染色質(zhì)是開放的，因此，如下圖A，我們只要人為地將攜帶已知DNA序列標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座復(fù)合物（即帶著紅色藍(lán)色測序標(biāo)簽的轉(zhuǎn)座酶Tn5）加入到細(xì)胞核中，這樣他就會插入到開放的染色質(zhì)區(qū)域，再利用已知序列的標(biāo)簽進(jìn)行PCR后測序，就知道哪些區(qū)域是開放染色質(zhì)了，這也就是ATAC-seq的原理。最后得到的DNA片段，包括了開放區(qū)域的剪切片段，也包括了橫跨一個或多個核小體的長片段。
根據(jù)片段長度，可以將片段分為分為Fragments in nucleosome-free regions(<147 base pairs)（不包含核小體的片段）、Fragments flanking a single nucleosome (147~294 base pairs)（包含一個核小體的片段）, 以及更長的多核片段。片段長度分布如下圖，不包含核小體的片段最多，其次是單核片段，依次遞減。
ATAC-seq出來的結(jié)果，和傳統(tǒng)方法出來的結(jié)果具有很強(qiáng)的一致性，同時也和基于組蛋白修飾marker的ChIP-seq有較高的吻合程度。也就是說，ATAC-seq中的peak，往往是啟動子、增強(qiáng)子序列，以及一些反式調(diào)控因子結(jié)合的位點(diǎn)。
scATAC-seq建庫原理
ATAC-seq是把所有實(shí)驗細(xì)胞看作了一個整體，獲得所有細(xì)胞混合的基因信息。scATAC-seq是在ATAC-seq的基礎(chǔ)上，進(jìn)行細(xì)胞核的分選和標(biāo)記通過barcode識別細(xì)胞核，解決了不同細(xì)胞群體的異質(zhì)性的問題，能夠檢測出混雜樣品測序所無法得到的異質(zhì)性信息。
以10x 建庫方法為例，比較scATAC-seq 和scRNA-seq建庫方法的異同
二者都用膠珠（GEMs）的方法，不一樣的是ATAC膠珠上的序列中不用UMI，因為基因組只有一對序列，無需像RNA一樣定量。另外序列末端用接頭引物Read 1N代替PolyT。
scRNA-seq通過結(jié)合cDNA的PolyA尾進(jìn)行擴(kuò)增，而scATAC-seq的DNA片段沒有PolyA尾，取而代之的是Tn5酶轉(zhuǎn)座剪切時插入的adaptors片段，可以與膠珠上的Read 1N序列互補(bǔ)。
DNA片段接上膠珠后，在另一端加Read2和Sample index序列。在此之前，scRNA-seq需要將cDNA酶切至合適的片段長度，而scATAC-seq的片段不進(jìn)行打碎，接上Sample index和P7序列后進(jìn)行擴(kuò)增。
最后上機(jī)測序。scRNAseq如果是3‘單端測序，Read2讀取最近的100bp讀長，而Read1只讀取16bp的細(xì)胞barcode序列和10bp的UMI序列，共26bp。scATAC-seq則用雙末端測序，讀長一般不低于45bp。
scATAC-seq最后可以得到4個原始文件：
其中I1/2分別是barcode和sample index，R1/2是目的片段的雙末端。
下游分析（以Signac為例）
Signac包由Seurat同一團(tuán)隊開發(fā)，獨(dú)立于Seurat包，在2020年8月開始發(fā)布在GitHub上。目前仍是1.0.0版本。
1.?加載peaks, 細(xì)胞注釋和片段分布數(shù)據(jù)，并創(chuàng)建object。這個object和Seurat object類似，只是在assay里多了peaks等信息。這里的features不是基因，而是基因組的注釋區(qū)域，如啟動子，增強(qiáng)子等。
2.?質(zhì)控
3.?降維聚類
4.?創(chuàng)建基因活性矩陣。之前的聚類區(qū)域所用的features是peaks，為了展示不同分群基因活性的差異，首先要將scATAC-seq數(shù)據(jù)產(chǎn)生的peak matrix轉(zhuǎn)換整合成一個gene activity matrix（基因活性矩陣）。我們基于這樣一個簡單的假設(shè)：基因的表達(dá)活性可以簡單的通過基因上下游2kb范圍內(nèi)覆蓋的reads數(shù)的加和進(jìn)行定量，最后獲得一個gene * cell的表達(dá)矩陣
5.?與scRNA-seq數(shù)據(jù)的整合分析
6.?尋找細(xì)胞分群特異的peaks
7.?展示基因在不同細(xì)胞類型的開放程度
8.?此外還有其他分析，如TF footprinting等。footprinting顧名思義是指轉(zhuǎn)錄因子留下的印記，由于Tn5酶不能剪切到TF結(jié)合的區(qū)域，所以footprinting圖相對與TSS圖，中間有“凹陷”，凹陷的程度根據(jù)TF結(jié)合的時間確定
