作為一個科研垃圾，因為足夠幸運所以考上了北大，浪費著老板的資源，一天花掉4萬塊錢都算小事。
ATAC-seq建庫實驗失敗經(jīng)驗總結(jié)：
錯誤點:
- 過磁珠沒有按照protocal 進(jìn)行，主要體現(xiàn)在未離心直接加磁珠，重懸液體積加錯，推柱子時沒有從磁力架上取下來，直接推下去且沒有加任何液體。
- ATAC-seq實驗在pcr 的步驟忘記加入DNA聚合酶（TAE）
- 時間分別發(fā)生在中午吃完飯后1點（過磁珠），和晚上凌晨1點（ATAC-seq），屬于做實驗身體上疲憊和心態(tài)上著急導(dǎo)致的失誤。
- 時間上的失誤，早上7點到實驗室，從老鼠到磨脾臟計數(shù)一直拖到了中午一點，時間花掉6h，其中主要是計數(shù)時間拖久了，因為計數(shù)過程中不放心所以反復(fù)確認(rèn)同一個樣本的總細(xì)胞量，本次實驗從宏觀角度來說，樣本量只需要超過2*10^8即可，不需要過于糾結(jié)，磁珠后的計數(shù)明顯更重要。當(dāng)天開始做ATAC的時間是下午5點，所以過磁珠耽誤的時間更長，主要問題出現(xiàn)在重懸液體積加錯，5ml的體積過MS柱非常慢，還會直接導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。ATAC由于開始的時間過晚，到凌晨一點的時候疲乏困倦，導(dǎo)致沒注意到pcr擴(kuò)增第二頁的TAE擴(kuò)增酶，導(dǎo)致產(chǎn)量非常低。
以后需要：
- 做實驗前反復(fù)核對自己寫的protocol有無問題（咨詢同組，看商品說明書）。查找到每一個試劑的成分以及用途，好好理解protocol，結(jié)合官網(wǎng)說明書。
- word上的任何表格文字千萬不能分兩頁放，word的文字整齊度非常重要。
- 實驗前盲目自信，實驗中手忙腳亂。細(xì)節(jié)問題未得到解決，比如加樣如何更快更精確，比如在合適的時間節(jié)點標(biāo)注樣本管合適，比如做完上一步要腦子里面想清楚下一步做什么，并且看清楚protocal再做。如何更科學(xué)管理好實驗中每一步的時間？
- 做實驗的時候每一步都快速思考一下原理，確保一下試劑存在于體系中，感受一下每一步樣本發(fā)生了什么理化性質(zhì)的變化。
- 對protocal的熟悉程度不夠，需要大樣本練習(xí)，比如6只老鼠進(jìn)行模擬操作大樣本訓(xùn)練？
- ATAC-seq 的模板在進(jìn)行pcr之后，如果濃度很高的情況下，可以保存兩份，備份防止后半部分出錯還有補(bǔ)救的機(jī)會？pcr之后可以做雙鏈濃度檢測，確保pcr成功？
- 標(biāo)注管子學(xué)習(xí)，名字非常長的情況下，用編號標(biāo)注，做好記錄即可，否則浪費時間還看不清楚。
- 柱子上務(wù)必也同時做好標(biāo)記，不要直接按照順序排列，這樣做可以在過柱子失敗的情況下，溯源回去重新過柱子，不會造成太多損失。
- 做實驗任何懷疑，拿不準(zhǔn)的時候立刻匯報師姐，確保損失減少到最低。另外注意注意溝通的態(tài)度問題。
并思考一個問題，在沒有加入TAE擴(kuò)增酶的情況下，已經(jīng)做了片段篩選，還能回去重新進(jìn)行pcr擴(kuò)增，重新篩選嗎？
1.ATAC-seq的Tn5轉(zhuǎn)座酶作用？
轉(zhuǎn)座酶識別序列： AGATGTGTATAAGAGACAG、第一接頭序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCGTCG GCAGCGTC；第二接頭序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGG；其中， XXXXXXXX為Index序列。
給目的片段的兩條鏈兩端各添加一段帶著缺口的接頭，在pcr的72℃的延伸過程中，index會在TAE酶的作用下進(jìn)入到缺口中，在不加TAE的情況下，index 連接不上，轉(zhuǎn)座酶的序列也連接不上，在后續(xù)的過濾片段長短的過程中會清除掉全部的Tn5轉(zhuǎn)座酶的序列，再次進(jìn)行pcr并沒有作用，再次進(jìn)行pcr會導(dǎo)致產(chǎn)物中全部都是引物的二聚體。
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2.雙端的接頭是136，Tn5切割最小是40bp，加上接頭后文庫的長度最多在180-200bp，核小體是150-200bp，出現(xiàn)三個峰值并遞減。
3.在pcr體系中，不加TAE酶，在復(fù)蘇過程中發(fā)生了什么變化，雙鏈DNA會復(fù)蘇嗎？氫鍵的斷裂后修復(fù)這個過程進(jìn)行16個循環(huán)，在沒有酶的作用下雙鏈復(fù)合效率會非常低。
綜上不能。
