結(jié)果（上）：

使用CRISPR/Cas9突變順式作用元件（CRE）重新創(chuàng)建果實(shí)形狀的QTL

番茄馴化的主要特征是在果實(shí)大小方向上的顯著增加。而果實(shí)的大小在很大程度是由花中心皮數(shù)量的增加和后面種子隔室的增加。影響番茄心室數(shù)目的QTL包括參與經(jīng)典的CLAVATA-WUS莖細(xì)胞回環(huán)的基因。CLV-WUS調(diào)控著分生組織的大小。在CLV-WUS途徑中的突變，如在信號肽基因SLV3的突變，能夠?qū)е路稚M織增大由于莖細(xì)胞的過度分裂。過度分裂會導(dǎo)致花和水果中增加額外的器官而引起發(fā)育缺陷。番茄的野生種pim，能產(chǎn)生小的兩心室果實(shí)，對馴化后的番茄，fas和lcQTL對增加LC的數(shù)目和果實(shí)大小有作用。fas是由一個到位導(dǎo)致的部分功能的缺失。這個到位是番茄中CLV3啟動子的打亂，導(dǎo)致了在心室數(shù)目的增加效應(yīng)。相比之下，lc是一個弱的功能獲得性等位基因。之前該等位基因被認(rèn)為是SlWUS下游的預(yù)測的一個15bp的一個抑制元件的2個SNP有關(guān)系。而WUS基因是一個促進(jìn)莖細(xì)胞分裂的保守的同源異形基因。而沒有功能驗(yàn)證，這個順式作用元件有著擬南芥CArG元件的相同之處，而這個元件被限制MADS box轉(zhuǎn)錄因子AGAMOUS在花發(fā)育后期限制去下調(diào)WUS和終止分生組織的活性。

為了確定是否在知道的CERs上誘導(dǎo)突變能夠產(chǎn)生可預(yù)測的定量突變，我們使用CRISPR/Cas9去靶定預(yù)測的SlWUS的CArG元件。這對lc的影視是微弱的，在pim的漸滲系中有著11%的果實(shí)產(chǎn)生了3到4個心室產(chǎn)生。與此一致的是，lc并沒有導(dǎo)致SlWUS的表達(dá)量的明顯變化，這個結(jié)果表明，lc微弱影響表達(dá)的水平、時間和模式。顯著的是，來自帶有一個CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的在CArG元件中缺失4-bp的pim植株中10%的果實(shí)存在3個心室，這和lc的弱影響保持一致。我們之間表明聯(lián)合fas和lc來增加心室數(shù)目是由于在CLV-WUS循環(huán)中的異顯性上位。我們構(gòu)建了pim-lc CRfasNIL植株，發(fā)現(xiàn)這個心室數(shù)目超過fas單獨(dú)突變（76%：43%果實(shí)有3個或更多的心室）和pim lcNILfasNIL植株，這表明CArG的缺失等位基因模仿了lc的功能。重要的是，我們在栽培番茄品種M82證明了這個影響。M82中，60%的果實(shí)有2個心室，40%有3個心室。我們發(fā)現(xiàn)了帶有在抑制基序中存在5-bp缺失的lcCR的70%番茄果實(shí)存在3個或更多的心室。這個影響在雙突變體中得到加強(qiáng)。這些結(jié)果證明，lc是由于SlWUS CArG元件的突變導(dǎo)致的，并證明了QTL能夠通過突變已知功能的CRE來設(shè)計(jì)。

CLV3啟動子的CRISPR/Cas9突變產(chǎn)生了新的順式調(diào)控元件等位基因

重現(xiàn)lc的影響表明，靶向以前已知的順式調(diào)控區(qū)域的CRISPR/Cas9能夠創(chuàng)造已存QTL的新的等位基因。但是，那些來定位于調(diào)控區(qū)域的QTL來解釋的精確誘導(dǎo)的突變還是很少知道的，尤其是那些存在多SNP或者結(jié)構(gòu)變異（SVs）的QTL區(qū)域的例子。而且在順式調(diào)控元件中，模塊化的管理和內(nèi)在的冗余使定義有用的目標(biāo)變得極端挑戰(zhàn)，尤其是產(chǎn)生對特定數(shù)量性狀產(chǎn)生特定修飾。然而，我們假設(shè)這些特性能夠被利用去創(chuàng)造一系列順式調(diào)控等位基因，這些等位基因帶著包含許多gRNAs的基因的啟動子區(qū)域帶來的一系列定量轉(zhuǎn)錄和表型的改變。盡管在每一個目標(biāo)位點(diǎn)同步或不同步Cas9-gRNA引導(dǎo)的切割和不精確的修復(fù)，一組突變的類型能夠被誘導(dǎo)，包括在目標(biāo)位點(diǎn)的不同大小的缺失和小的插入。這些產(chǎn)生的等位基因形成的突變能夠影響許多的CRE，順式調(diào)控模塊或者她們的空間，能夠通過后代產(chǎn)生的穩(wěn)定同義突變而出現(xiàn)的表型為被評價。

我們通過設(shè)計(jì)一個CRISPR/Cas9的包含8個靶向M82 SlCLV3編碼區(qū)緊接上游的2-Kb的啟動子區(qū)域的而沒有考慮任何預(yù)測的CERs的gRNAs載體來檢驗(yàn)這個概念。6個第一代轉(zhuǎn)基因植株（T0）按照以前的方法被產(chǎn)生。顯著的是，這些植株的花產(chǎn)生處理更多的器官和WT相比，T0-2擁有的器官數(shù)目在fas和CRISPR/Cas9產(chǎn)生的clv3編碼區(qū)的敲除突變。PCR和測序認(rèn)為T0-2是帶有前4個靶點(diǎn)出有一個小缺失和從第5個開始超過第8個靶點(diǎn)的一個1Kb的缺失的等位基因的純合子。比較起來，T0-1表型出的是所有目標(biāo)靶點(diǎn)存在1.6Kb的大缺失的純合子，但是器官數(shù)目上只一點(diǎn)點(diǎn)的改變。4個剩下的T0植株中的2個表型出弱的影響，并至少是3個等位基因的嵌合體，其中在T0-4中的一個等位基因和T0-1有相同的缺失。

在第一代轉(zhuǎn)基因中獲得來自CRISPR/Cas9的純合突變體是很稀少的，考慮到那個1.6Kb的缺失超過了T0-2的絕大部分的缺失的弱突變的T0-1的表型是令人奇怪的。為了檢測這些等位基因的遺傳性和證實(shí)他們的表型影響，我們對通過自己產(chǎn)生的T1后代進(jìn)行基因分型。出人意料的，T0-1和T0-2的后代遺傳了一個不能夠通過PCR擴(kuò)增等位基因。在每一個T1后代中，為了掩蓋的基因接近四分之一的純合子分離比表明，T0植株是雙等位基因，帶著第二個等位基因潛在的有一個大的阻止PCR擴(kuò)增的結(jié)構(gòu)變化。為了更好的鑒定這些等位基因，我們對純合的T2后代的基因組進(jìn)行測序，基因組表明在T0-1的另一個等位基因存在一個復(fù)雜的重排，和一個在T0-2中跨過CLV3編碼序列的7.3Kb的缺失。我們后來用這些數(shù)據(jù)表明沒有可以檢測到的脫靶突變，這支持CRISPR/Cas9的高度專一性。定量基因型表明，SlCLV3CR-pro2-2純合子在花器官上的增加與clv3CR突變體一直，證明了SlCLV3CR-pro2-2是一個空的等位基因。相比較而言，來源于T0-1和T0-2純合子表現(xiàn)出比clv3cr更輕微的影響，表明了亞等位基因的基因型。最后，我們發(fā)現(xiàn)，SlCLV3CR-pro1-2純合體很想WT，解釋了原始雙等位基因T0-1植株的微弱表型。這些結(jié)果說明帶著各種靶向一個啟動子的不同區(qū)域的gRNAs的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株能夠有效的創(chuàng)造新的順式調(diào)控突變體和產(chǎn)生表型變化的等位基因，可能包括靶區(qū)域內(nèi)外的意外損傷。

一個順式工作的CRISPR/Cas9-驅(qū)動的突變體篩選允許slCLV3啟動子等位基因定量突變的快速產(chǎn)生和評價

Atrans-Acting CRISPR/Cas9-DrivenMutagenesis

來自于T0植物中的SlCLV3啟動子的等位基因表明靶向調(diào)控序列的CRISPR/Cas9能夠產(chǎn)生新的基因型和表型突變。然而，每一個T0植物只提供少許帶著或強(qiáng)或若的影響。在早期，我們期待數(shù)十個或更多的等位基因?qū)⒈恍枰@得一系列等位基因能夠包含全方法位的定量突變。然而，標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因方法將是費(fèi)時間和錢的。為了解決這些限制，我們設(shè)計(jì)了一個簡單的開發(fā)反式后的CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因的通過與野生雜交的誘導(dǎo)出更多突變的遺傳遺傳流程。使用這種方法，來自于一個T0的雜合子個體遺傳了單拷貝的轉(zhuǎn)基因的所有F1植株將有產(chǎn)生一個或更多的新的等位基因的潛能通過靶向野生啟動子通過雜交產(chǎn)生的。然而，確定那個特異的F1個體擁有新的引起表型變化的等位基因是非常困難的。一個可以講述的例子是CLV3CR-pro1-2等位基因的復(fù)雜重排，這個等位基因?qū)ㄆ鞴贁?shù)目沒有影響，因此補(bǔ)充和掩蓋了來源于雙等位基因的T0-1植株中強(qiáng)的失去功能的大的缺失的等位基因的影響。同時的為了最大化等位基因的創(chuàng)造和有效識別這些表型，我們對擁有強(qiáng)的丟失功能的等位基因的T0進(jìn)行雜交去產(chǎn)生一個激活的雜合的F1植株群體。使用這種方法，帶有一個CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)基因，已經(jīng)遺傳了一個穩(wěn)定的缺失功能的等位基因的成百的F1后代，能夠容易獲得和用于篩選新新的失去功能的等位基因，包括那些導(dǎo)致細(xì)微的很難被檢測的表型。

為了檢測這種方法，我們雜交T0-2和WT產(chǎn)生了1152個由SlCLV3CR-pro2-1 or SlCLV3CR-pro2-2 和一個a WT SlCLV3 promoter組成的雜合的F1植株。PCR基因型表面幾乎一半的群體（42%）遺傳了CRISPR/Cas9的轉(zhuǎn)基因，對這些植株的479植株表型分型表面116個單株比對照有更多的話器官。而80%的植株顯示弱的影響，24顯示出和fas相似或更強(qiáng)的表型。這些發(fā)現(xiàn)表明了結(jié)合了減少遺傳的Cas9-gRNA的活性和一個敏感的背景去高效產(chǎn)生大量的順式調(diào)控帶著明顯表型影響的力量。