前列腺癌(prostatecancer,PCa)是一種常見的惡性腫瘤，其進展過程中常常伴隨著癌癥干細胞特性的增強、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）現(xiàn)象的發(fā)生以及對傳統(tǒng)治療的抵抗。Wnt/β-catenin信號通路在胚胎發(fā)育、干細胞維持以及癌癥進展中發(fā)揮重要作用，其異常激活與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。NURR1是一種沒有配體或目前尚未發(fā)現(xiàn)配體的孤兒核受體蛋白，原本在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中異常表達，并可能參與癌癥進展。然而，NURR1在前列腺癌中的具體作用及其與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系尚不清楚。

近日，南方醫(yī)科大學附屬深圳龍華醫(yī)院泌尿外科副研究員王鑄博士和香港中文大學醫(yī)學院Franky Leung Chan合作研究了核受體NURR1（NR4A2）在前列腺癌中的作用機制，特別是其如何通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路影響前列腺癌的干細胞特性、EMT以及去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC）的進展。研究通過一系列體外和體內(nèi)實驗，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學（RNA-seq）和表觀遺傳學技術(shù)（ChIP），揭示了NURR1在前列腺癌中的促癌作用，并提出了其作為潛在治療靶點的可能性。相關(guān)研究成果以《Nuclear receptor NURR1 functions to promote stemness and?epithelial-mesenchymal transition in prostate cancer via its targeting of Wnt/β-catenin signaling pathway》為題發(fā)表于《Cell Death?& Disease》期刊。

標題：Nuclear receptor NURR1 functions to promote stemness and epithelial-mesenchymal transition in prostate cancer via its targeting of Wnt/β-catenin signaling pathway（核受體 NURR1 通過靶向 Wnt/β-catenin 信號通路促進前列腺癌的干性和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化）

發(fā)表時間：2024-3-24

發(fā)表期刊：Cell Death & Disease

影響因子：IF 8.1/Q1

技術(shù)平臺：RNA-seq、ChIP-qPCR

研究摘要

Wnt/β-catenin信號通路的失調(diào)激活是多種癌癥晚期進展中的常見事件。這種信號激活增強了腫瘤的生長，并促進了轉(zhuǎn)移和治療抵抗。研究表明，該信號通路在癌癥進展過程中對細胞過程（EMT和癌癥干性）具有雙重調(diào)控作用。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活在前列腺癌以及去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）中較為常見。然而，前列腺癌中該通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子尚未得到充分研究。NURR1（NR4A2）是一種孤兒核受體，在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。先前研究表明，NURR1在分離的前列腺癌干細胞（PCSCs）和CRPC異種移植模型中表現(xiàn)出上調(diào)。本研究進一步證實了NURR1在前列腺癌中的上調(diào)，并在前列腺癌細胞系中表現(xiàn)出增強的表達。功能和分子分析表明，NURR1能夠通過直接轉(zhuǎn)錄激活CTNNB1（β-catenin）并激活β-catenin來介導Wnt/β-catenin信號通路激活，從而促進體外（癌癥干性和EMT）和體內(nèi)前列腺癌細胞的腫瘤生長（轉(zhuǎn)移和去勢抵抗）。此外，本研究還驗證了前列腺癌細胞中NURR1的活性可以通過小分子進行調(diào)控，表明NURR1可能是晚期前列腺癌管理的潛在治療靶點。

圖形摘要

研究方法

樣本采集：多種前列腺癌細胞系（包括LNCaP、VCaP、22Rv1、DU 145和PC-3）、永生化前列腺上皮細胞系（BPH-1）。此外還利用前列腺組織微陣列（包含良性前列腺增生和不同Gleason評分的前列腺癌組織）進行免疫組化分析。樣本采集涵蓋從細胞系到臨床組織。

免疫組化和免疫印跡分析：檢測NURR1在前列腺癌組織和細胞系中的表達水平。

RNA測序（RNA-seq）：通過對比NURR1過表達和對照組的前列腺癌細胞系，分析差異表達基因，揭示NURR1可能調(diào)控的信號通路。

染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP-qPCR）：驗證NURR1是否直接結(jié)合到CTNNB1啟動子區(qū)域，從而調(diào)控其表達。

報告基因分析和基因編輯技術(shù)：通過構(gòu)建含CTNNB1啟動子的熒光素酶報告基因質(zhì)粒，以及CRISPR/Cas9介導的基因敲除，驗證NURR1對CTNNB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

體外和體內(nèi)功能實驗：包括細胞增殖、遷移、侵襲實驗以及異種移植瘤模型，評估NURR1對前列腺癌細胞生物學行為的影響。

結(jié)果圖形

（1）NURR1在前列腺癌組織和前列腺癌細胞中表達上調(diào)

通過免疫組化和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，NURR1在前列腺癌組織和細胞系中的表達顯著高于正常前列腺組織和細胞。

圖1：NURR1在臨床前列腺癌組織和前列腺癌細胞系中的表達上調(diào)。 A-B. 通過對兩個臨床前列腺癌組織的微陣列數(shù)據(jù)集進行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示NURR1在前列腺癌中表現(xiàn)出上調(diào)的表達模式。 C-D. 前列腺癌組織微陣列中NURR1的免疫組化分析。 E.?? NURR1免疫印跡分析。多種前列腺癌細胞系的NURR1表達水平高于永生化前列腺上皮細胞BPH-1。

（2）轉(zhuǎn)錄組分析表明NURR1參與Wnt/β-catenin信號激活

RNA-seq和GSEA分析顯示NURR1過表達組中Wnt/β-catenin信號通路顯著富集。

圖 2：Wnt/β-catenin信號通路參與NURR1過表達的前列腺癌 A. DU 145-NURR1和-Vector感染細胞的RNA-seq數(shù)據(jù)的基因集富集分析（GSEA）氣泡圖。結(jié)果顯示，與對照組（Vector）相比，NURR1過表達組（NURR1）中Wnt/β-catenin信號是最顯著富集通路。 B. DU 145-NURR1和-Vector感染細胞以及NURR1高表達和低表達組的GSEA結(jié)果，顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路的富集情況。 C. 基于NURR1表達水平將患者分為高表達和低表達組，展示TCGA數(shù)據(jù)庫患者的RNA-seq數(shù)據(jù)的GSEA氣泡圖。結(jié)果顯示，與NURR1低表達組相比，NURR1高表達組中Wnt/β-catenin信號通路顯著富集。 D. 對TCGA數(shù)據(jù)庫中的前列腺腺癌數(shù)據(jù)集（PRAD）進行表達分析，結(jié)果顯示NR4A2與CTNNB1在原發(fā)性前列腺癌組織中呈正相關(guān)表達。 E-F. DU 145-NURR1感染細胞和DU 145-shNURR1感染細胞中CTNNB1（β-catenin）表達的RT-qPCR分析。結(jié)果顯示，與載體或?qū)φ战M相比，DU 145-NURR1感染細胞中CTNNB1顯著上調(diào)，而DU 145-shNURR1感染細胞中CTNNB1表達下調(diào)。

（3）NURR1通過直接轉(zhuǎn)錄激活CTNNB1來激活前列腺癌細胞中的β-catenin信號通路。

ChIP和報告基因分析進一步證實NURR1能夠直接結(jié)合到CTNNB1啟動子并激活其轉(zhuǎn)錄，進而增加β-catenin的蛋白表達和核內(nèi)積累。

圖3：NURR1可以通過直接轉(zhuǎn)錄激活CTNNB1以及激活β-catenin來激活前列腺癌細胞中的Wnt/β-catenin信號通路

A. CTNNB1啟動子的1.3 kb片段驅(qū)動的報告基因構(gòu)建示意圖，以及三個包含點突變NBRE的報告基因構(gòu)建。

B. 熒光素酶報告基因分析。結(jié)果顯示，只有完整的NURR1，而不是其DNA結(jié)合域缺失突變體NURR1-ΔDBD，能夠以劑量依賴的方式轉(zhuǎn)錄激活CTNNB1啟動子驅(qū)動的報告基因。然而，NURR1不能轉(zhuǎn)錄激活包含點突變NBRE的報告基因。

C. 染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析。結(jié)果顯示在HEK293細胞中，CTNNB1啟動子上的假定NURR1結(jié)合位點富集了NURR1。IgG作為陰性對照。

D-E. AR陽性（LNCaP、22Rv1）和AR陰性（DU 145）前列腺癌細胞中β-catenin的免疫印跡分析，這些細胞分別過表達NURR1或敲低NURR1。結(jié)果顯示，LNCaP和DU

145細胞中NURR1的過表達能夠增加總β-catenin及其活性形式（去磷酸化或核內(nèi)）的蛋白水平，而22Rv1和DU 145細胞中NURR1的敲低則能夠減少這些蛋白水平。然而，在這些前列腺癌細胞中，NURR1的過表達或shRNA敲低并未觀察到非活性或磷酸化β-catenin蛋白水平的顯著變化。

F-G. DU 145和22Rv1細胞中β-catenin信號通路下游調(diào)節(jié)因子的免疫印跡分析，這些細胞經(jīng)過NURR1激動劑C-DIM-12（5 μM）或Wnt抑制劑IWP-2（10 μM）處理。

（4）NURR1可以促進前列腺癌細胞的體外干細胞特性和EMT

體外實驗表明，NURR1過表達能夠增強前列腺癌細胞的非貼壁生長能力、遷移和侵襲能力，并誘導EMT相關(guān)標志物的表達變化。

圖4：NURR1能夠增強前列腺癌細胞的體外干細胞特性。 A-D. 非貼壁3D培養(yǎng)球體形成實驗。 E-F. NURR1和shNURR1感染株及其經(jīng)C-DIM-12或IWP-2處理的感染株中前列腺癌干細胞（PCSCs）相關(guān)標志物的免疫印跡分析。

（5）NURR1可在體內(nèi)促進前列腺癌細胞的去勢抵抗

圖5：NURR1能夠增強前列腺癌細胞的體內(nèi)去勢抵抗性生長（A、B 體內(nèi)致瘤性實驗）。 A. 顯微照片顯示在去勢后5周，由VCaP-NURR1和VCaP-載體感染細胞在宿主小鼠中生長的異種移植腫瘤，以及經(jīng)過IWP-2處理的VCaP-NURR1感染細胞形成的腫瘤。 B. 對去勢小鼠中由NURR1感染細胞形成的異種移植腫瘤大小進行半定量分析。 C. 對VCaP-NURR1感染細胞形成的去勢復發(fā)性異種移植腫瘤進行免疫印跡分析。

（6）NURR1可能起到促進前列腺癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移潛力的作用

圖6：NURR1能夠促進前列腺癌細胞的體外遷移和侵襲能力 A-B. 劃痕愈合實驗。 C-D. Transwell侵襲實驗。 E-F. NURR1和shNURR1感染細胞中EMT標志物的免疫印跡分析。 G.? 經(jīng)C-DIM-12/IWP-2處理或聯(lián)合CTNNB1敲除的DU 145-NURR1感染細胞中EMT標志物的免疫印跡分析。?

圖7：通過斑馬魚胚胎模型驗證NURR1能夠增強前列腺癌細胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移潛力 A. 將RFP（紅色熒光蛋白）標記的PC-3-NURR1/載體感染細胞微注入flk:GFP（綠色熒光蛋白標記血管）斑馬魚胚胎（受精后48小時）發(fā)育中的心臟區(qū)域。 B. 在注射后第4天，通過熒光顯微鏡觀察到的PC-3-NURR1/載體感染細胞在斑馬魚頭部（頭）和尾部（尾）區(qū)域的遷移情況。綠色代表血管，紅色代表PC-3感染細胞。顯微鏡觀察顯示，在注射后第4天，PC-3-NURR1感染細胞在斑馬魚的頭部和尾部區(qū)域有顯著數(shù)量的細胞遷移，而PC-3-載體感染細胞在這些區(qū)域幾乎未被檢測到。然而，經(jīng)過C-DIM-12處理的斑馬魚中檢測到了大量PC-3-載體感染細胞。另一方面，CTNNB1敲除的PC-3-NURR1感染細胞在斑馬魚的頭部和尾部區(qū)域未被檢測到，但在血管中有少量細胞被檢測到。 C. 對遷移至斑馬魚頭部和尾部區(qū)域的PC-3-NURR1/載體感染細胞進行定量分析。 D. 對遷移到斑馬魚遠端部位的PC-3-NURR1/載體感染細胞中EMT標志物的表達進行RT-qPCR分析。結(jié)果顯示，與PC-3-載體感染細胞相比，遷移的PC-3-NURR1感染細胞表現(xiàn)出增強的EMT標志物表達特征（SNAIL1和KLF4水平增加，E-鈣粘蛋白水平降低）。用C-DIM-12處理斑馬魚能夠顯著增加CD44的表達。CTNNB1敲除的遷移PC-3-NURR1感染細胞顯示出MMP9表達降低。 E. NURR1在晚期前列腺癌中通過直接靶向CTNNB1（β-catenin）促進去勢抵抗性、轉(zhuǎn)移和癌癥干性的作用機制模式圖。

易小結(jié)

本研究結(jié)果表明，NURR1在前列腺癌中通過直接調(diào)控CTNNB1的轉(zhuǎn)錄激活Wnt/β-catenin信號通路，進而促進前列腺癌細胞的干細胞特性、EMT、去勢抵抗性和轉(zhuǎn)移能力。因此，NURR1及其調(diào)控的Wnt/β-catenin信號通路可能成為治療前列腺癌的潛在靶點。

RNA-seq和ChIP技術(shù)在本研究中的作用

RNA-seq技術(shù)：用于分析NURR1過表達對前列腺癌細胞轉(zhuǎn)錄組的影響。通過對比NURR1過表達和對照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，研究人員發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路在NURR1過表達組中顯著富集，這提示NURR1可能通過調(diào)控該信號通路影響前列腺癌的生物學行為。

ChIP技術(shù)：用于驗證NURR1是否直接結(jié)合到CTNNB1啟動子區(qū)域。研究人員通過發(fā)現(xiàn)NURR1能夠特異性地結(jié)合到CTNNB1啟動子上的一個特定序列（NBRE），從而為NURR1直接調(diào)控CTNNB1表達提供了直接證據(jù)。

參考文獻：

Zhang, X., Li, H., Wang, Y.?et al.?Nuclear receptor NURR1 functions to promote stemness and epithelial-mesenchymal transition in prostate cancer via its targeting of Wnt/β-catenin signaling pathway.?Cell Death Dis?15, 234 (2024).https://doi.org/10.1038/s41419-024-06621-w