三十六策 第 9 策 因材施教

三十六策 第 9 策 因材施教

套路來源于文獻，又高于文獻，是文獻中普遍存在的論證規(guī)律。

三個階段：

第一階段，看山不是山，看水不是水

第二階段，看山是山，看水是水

第三階段，看山不過是山，看水不止是水

一項完整的蛋白功能研究它的標準：

1. 檢測分子的基礎表達

   • 分子為變量的研究中第一個 Figure 往往是檢測目標分子的表達水平。

     • 把病理組織和對照組進行比較，搞清楚疾病過程中這個分子在組織中的表達是否明顯改變了，這種改變還可以結合其他病理特征進行統(tǒng)計分析

     • 檢測細胞模型的表達變化或者動物模型的特定組織中的表達改變。

     • qPCR 、 WB、組織還要做免疫組化

     • 過表達了獲得表型，沉默了失去表型

     • 檢索基因序列的數(shù)據(jù)庫： Gene、Nucleotide 和 Protein

2. 制作過表達或者沉默的載體工具

   • 腺病毒：用于基因過表達實驗的載體，做 RNA 干擾的時候免疫源性比較強，不推薦

   • 慢病毒：適合于做 RNAi 實驗、CRISPR 實驗

   • shRNA：發(fā)卡狀的 shRNA 正是 siRNA 的前體，在細胞里面會被自動切割加工為 siRNA，質粒和病毒載體上都會用shRNA的結構

   • 把質粒或者病毒導入到細胞內，抽提細胞的 mRNA 和蛋白，檢測它的表達情況在組織和細胞里檢測表達差異一樣，還需要設置一個陰性對照

     • 過表達實驗里是空載體，里面沒有負載任何基因

     • 在 RNAi 實驗里是一段打亂序列不影響任何基因表達的序列，也就是無效的 siRNA

   • Fig.2 里面的小圖 a，應該先提供過表達或者沉默有效的證據(jù)

3. 檢測表型功能的實驗

   • Fig.2 剩下的那些小圖

   • in vitro的結果

4. 體內動物實驗

   • Fig.3 in vivo的表型驗證

5. Rescue 實驗 回復實驗

   • 同一個條件下先正向再反向，或者先反向再正向觀察表型的得而復失或者失而復得

   • 很好排除現(xiàn)象背后的假陽性本質，建立可靠的因果邏輯

   • 單變量論證

     • 先把基因用 siRNA 沉默掉

     • 穩(wěn)定沉默這個基因的細胞分兩組

     • 一組轉對照，另一組轉入過表達載體，然后觀察表型變化

     • 過表達后能夠把原來沉默失去的表型回復回來，證明該表型是依賴于這個分子存在而存在的

總結

五步總結起來是 12 個字——表達差異、正反回復、細胞動物