? ? ? ?近年來，隨著測序成本的不斷降低，轉(zhuǎn)錄組測序已經(jīng)成為解析基因組的功能成分、揭示細胞和組織的分子成分以及理解發(fā)育和疾病必不可少的技術(shù)手段，已廣泛應用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷等領(lǐng)域。發(fā)表論文作為檢驗研究成果的一條重要途徑，大家都在思考高分文章到底該從何入手，一方面需要全面、細致的實驗設計，但另一方面，區(qū)別于常規(guī)的分析內(nèi)容，清晰明了又好看的結(jié)果圖片也都會為文章添磚加瓦！那轉(zhuǎn)錄組測序除了常見的差異基因通路富集及結(jié)構(gòu)分析之外，還有哪些適用的分析內(nèi)容呢？

? ? ? ?本文給大家?guī)怼稗D(zhuǎn)錄組時序分析”實操，希望給各位老師數(shù)據(jù)分析帶來一些幫助。更多轉(zhuǎn)錄組個性化分析內(nèi)容，后續(xù)將陸續(xù)推送，大家敬請期待！

1.時間序列分析的意義

? ? ? ?1）將表達相似的基因聚集為1類，表達相似的基因可能具有相似的生物學功能或者共同的細胞起源；

? ? ? ?2）基因調(diào)控的順序，基因間存在誘導或者阻遏；

? ? ? ?3）同一種處理在不同的時間下，生物學動態(tài)變化。

2.Mfuzz軟件包

? ? ? ?Mfuzz是專門的做轉(zhuǎn)錄變化的時間趨勢分析的方法，核心算法基于模糊c均值聚類（Fuzzy C-Means Clustering，F(xiàn)CM），是基于R編程的軟件包。

聚類方法：如果一個聚類方法假定一個樣本只能屬于一個類，或類的交集為空集，那么該方法稱為硬聚類（hard clustering）方法；如果一個樣本可以屬于多個類，或類的交集不為空集，那么該方法稱為軟聚類（soft clustering）方法。

3.Mfuzz包安裝及加載

? ? ? ?使用 Bioconductor 安裝 Mfuzz 包

install.packages('BiocManager')

BiocManager::install('Mfuzz')????##當出現(xiàn) package(s) not installed when version(s) same as current; use `force = TRUE` to re-install:

BiocManager::install('Mfuzz',force = TRUE) ##具體命令

library(Mfuzz)????#加載 Mfuzz 包

4.數(shù)據(jù)準備

? ? ? ?all.fpkm.xls ##基因表達矩陣

? ? ? ? #該示例中，第一列為基因或蛋白名稱，第一行為時間樣本序號（按時間順序提前排列好，若存在生物學重復需提前取均值）? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

5.讀取矩陣表格

gene <- read.delim('all.fpkm.xls', row.names = 1, check.names = FALSE)

gene <- as.matrix(mRNA)

6.構(gòu)建對象

mfuzz_class <- new('ExpressionSet',exprs = gene)

7.缺失值或者異常值過濾

mfuzz_class <-?filter.NA(mfuzz_class, thres = 0.25)

mfuzz_class <-?fill.NA(mfuzz_class, mode = 'mean')

mfuzz_class <- filter.std(mfuzz_class, min.std = 0)

#通常來說，比較受歡迎的就是樣本的標準差作為閾值

8.標準化數(shù)據(jù)

mfuzz_class <- standardise(mfuzz_class)

#Mfuzz 基于 fuzzy c-means 的算法進行聚類

#需手動定義目標聚類群的個數(shù)，如望獲得 10 組聚類群

#需要設定隨機數(shù)種子，以避免再次運行時獲得不同的結(jié)果

set.seed(123)

cluster_num <- 10

mfuzz_cluster<- mfuzz(mfuzz_class, c = cluster_num, m = mestimate(mfuzz_class))

9.作圖

#time.labels 參數(shù)設置時間軸，需要和原基因表達數(shù)據(jù)集中的列對應

#顏色、線寬、坐標軸、字體等細節(jié)也可以添加其他參數(shù)調(diào)整，此處略，詳見函數(shù)幫助

mfuzz.plot2(mfuzz_class, cl = mfuzz_cluster, mfrow = c(3, 5), time.labels = colnames(gene))

10.查看相關(guān)結(jié)果

查看每個聚類群中各自包含的蛋白數(shù)量

cluster_size <- mfuzz_cluster$size

names(cluster_size) <- 1:cluster_num

cluster_size

查看每個蛋白所屬的聚類群

head(mfuzz_cluster$cluster)

#Mfuzz 通過計算 membership 值判斷基因所屬的聚類群，以最大的 membership 值為準

查看各基因的 membership 值

head(mfuzz_cluster$membership)

提取所有基因所屬的聚類群，并和它們的原始表達值整合在一起

gene_cluster <- mfuzz_cluster$cluster

gene_cluster <- cbind(gene[names(gene_cluster), ], gene_cluster)

head(gene_cluster)

write.table(gene_cluster, 'gene_cluster.txt', sep = '\t', col.names = NA, quote = FALSE)

11.結(jié)果解讀

圖片來自官網(wǎng)示例（部分圖）

如何評判聚類的好壞？

因為該圖由基因的變化趨勢聚類得到的，所以如果聚類越好，意味著每個cluster

中線段的走向一致。

如何判斷聚類的個數(shù)？

Dmin圖