Identification and validation of key molecules associated with humoral immune modulation in Parkinson's disease based on bioinformatics

基于生物信息學(xué)的帕金森病體液免疫調(diào)節(jié)相關(guān)關(guān)鍵分子的鑒定和驗證

發(fā)表期刊：Front Immunol

發(fā)表日期：2022 Sep 15

影響因子：8.786

DOI:? 10.3389/fimmu.2022.948615

一、研究背景

????????隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展的進步，人們的預(yù)期壽命大大增加；特別是隨著老齡化程度的增加，與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率也隨之提高。帕金森病（PD）是最常見的神經(jīng)退行性運動障礙，其發(fā)病年齡通常在65-70歲之間。

????????神經(jīng)免疫性炎癥可以保護神經(jīng)元免受損害，但其毒性作用也會加劇神經(jīng)元的紊亂，這主要是由細胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的先天免疫細胞和外周侵入性免疫細胞引起的。神經(jīng)退行性疾病中血腦屏障（BBB）的破壞使血液中的神經(jīng)毒性物質(zhì)、細胞和微生物病原體進入大腦，這些與炎癥和免疫反應(yīng)有關(guān)，可以啟動各種神經(jīng)退行性疾病的途徑。炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞表達某些粘性分子，吸引更多的外周免疫細胞和抗體通過BBB進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

二、材料與方法

1、數(shù)據(jù)來源

1） 基因表達數(shù)據(jù)GSE100054（10個PD和9個HC）和GSE49126（30個PD和20個HC）

2） GSE22491（10個PD和8個HC）被用來作為驗證數(shù)據(jù)集

3） 從三位神經(jīng)退行性疾病專家那里招募了69名PD患者，以及36名年齡和性別匹配的健康對照者

2、分析流程

1） 差異表達基因的鑒定：limma，采用線性模型來評估PD患者和健康對照組之間的差異表達；所有的DEGs與疾病數(shù)據(jù)庫DisGeNET中記錄的與帕金森病相關(guān)的基因相交，得到感興趣的DEGs

2） PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和模塊分析：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）是用STRING構(gòu)建的

3） DEGs和重要模塊的KEGG和GO富集度分析：Fisher's精確檢驗對GO分類進行評估，使用關(guān)鍵詞 "免疫"，確定了39條參與免疫相關(guān)生物過程的途徑，共獲得13個分子

4） 對PD分子特征的驗證：在數(shù)據(jù)集GSE22491中，比較了PD患者和健康對照組中13個分子的表達水平；選擇PPBP、PROS1和LCN2三個分子進行實驗驗證

5） PBMC分離、RNA提取和反轉(zhuǎn)錄、定量實時聚合酶鏈反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗

流程圖

三、實驗結(jié)果

01 - 識別差異表達的基因

????????作者從GEO數(shù)據(jù)庫下載了微陣列表達數(shù)據(jù)集。根據(jù)上述選擇標(biāo)準(zhǔn)進行差異表達分析后，在GSE100054中得到373個DEGs，包括337個上調(diào)基因和36個下調(diào)基因，在GSE49126中得到384個DEGs，包括200個上調(diào)基因和184個下調(diào)基因。進行主成分分析（PCA）并以散點圖顯示，其中每個點代表一個樣本（圖2A，C），在火山圖中以不同顏色顯示篩選出的組間差異明顯的基因（圖2B，D）。用GSE100054和GSE49126來識別不同表達的基因（DEGs），然后分別與DisGeNET數(shù)據(jù)庫記錄的PD相關(guān)基因相交（圖3A）。

圖2 基因芯片的PCA圖和不同表達基因的火山圖

????????為了描述差異表達基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用，從STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建了一個PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3B）。該網(wǎng)絡(luò)由92個節(jié)點和293條邊組成；節(jié)點代表感興趣的DEGs，邊代表基因之間的相互作用。然后將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入cytoscape進行可視化，并使用MCODE進行聚類相關(guān)分析。最后，得到三個高分的聚類，即聚類1（17個節(jié)點，得分8.7，圖3C）、聚類2（7個節(jié)點，得分4.3，圖3D）和聚類3（3個節(jié)點，得分3.0，圖3E）。

圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達模塊

02 - DEGs的功能富集和重要模塊

????????基于智人背景的clusterProfiler軟件包對感興趣的DEGs（94個基因）和Hubgenes（27個基因）進行了富集分析，以獲得富集信息。通過GO分類和富集分析，如生物過程、細胞成分、分子功能等，揭示了與PD相關(guān)的功能注釋詞，并探討了其生物學(xué)意義。為了揭示與感興趣的DEGs和Hubgenes相關(guān)的生物學(xué)途徑，利用KEGG數(shù)據(jù)庫獲得了重要的信號通路。

????????DEGs富集的生物學(xué)過程主要包括炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、血小板脫顆粒、免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)分子介質(zhì)的產(chǎn)生、白細胞增殖、參與免疫反應(yīng)的細胞因子產(chǎn)生、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等（圖4A）。在 "細胞成分"方面，DEGs主要富集在囊泡腔、血小板α顆粒腔、質(zhì)膜外側(cè)、運輸囊泡等區(qū)域（圖4B）；在 "分子功能"方面，DEGs主要與細胞因子活性、受體配體活性、NAD+核苷酶活性、白介素-1受體結(jié)合等有關(guān)（圖4C）。在KEGG的富集分析中，DEGs主要涉及脂質(zhì)和動脈硬化、MAPK信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、HIF-1信號通路、炎癥性腸病和膽固醇代謝等（圖4D）。

圖4 DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

????????Hubgenes富集的生物過程主要包括參與免疫反應(yīng)的細胞因子產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、血小板脫顆粒、膠質(zhì)細胞激活、細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)等（圖5A）。在 "細胞成分"方面，Hubgenes主要富集在囊泡腔、分泌顆粒腔、膜區(qū)和其他區(qū)域（圖5B）。在 "分子功能"方面，表明Hubgenes主要與細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合、淀粉樣蛋白-β結(jié)合、C-C趨化因子受體活性等有關(guān)（圖5C）。在KEGG的富集分析中，Hubgenes主要涉及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細胞因子-細胞因子受體相互作用、癌癥中的蛋白多糖、PI3K-Akt信號通路、壞死、糖尿病并發(fā)癥的AGE信號通路等（圖5D）。

圖5 Hubgenes的GO和KEGG分析結(jié)果

03 - 鑒定和驗證PD的分子特征

????????作者基于27個Hubgenes（以 "免疫 "為關(guān)鍵詞）進行了基因本體論（GO）的生物過程分析，篩選出39條免疫相關(guān)的通路，并從上述Hubgenes中選出13個靶分子，如CCR2、CD 44、TLR2、TLR4、IL4、IL-1B、IL-33、TGFB2、PPBP、PROS1、CLU、LCN2和NLRP3。GSE22491被選為驗證數(shù)據(jù)集以比較這些分子在PD和HC中的表達水平。IL-1B、TGFB2、CLU、IL33和NLRP3的表達在兩組之間沒有明顯差異；其他基因被認(rèn)為有明顯差異（圖6）。根據(jù)以往的研究和實驗實施的客觀條件，選擇了PPBP、LCN2和PROS1進行以下實驗。與HC相比，這三個分子在PD中都有所下降（圖6）；但在GSE100054中，PPBP、PROS1和LCN2的表達水平高于HC（圖7A-C）。在免疫相關(guān)的生物過程中，PPBP和LCN2主要參與體液免疫反應(yīng)和中性粒細胞激活參與免疫反應(yīng)；然而，除了體液免疫反應(yīng)，PROS1也參與調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)和免疫效應(yīng)器過程。

圖6 GSE22491中13個基因的表達水平

圖7 GSE100054中PD患者和健康對照的PPBP、PROS1和LCN2的表達水平

04 - 在轉(zhuǎn)錄水平上對選定的差異分子進行驗證

????????作者招募了69名PD患者（39名男性和30名女性）和36名健康對照（19名男性和17名女性）。從這些參與者中，首先，選擇了一些進行mRNA表達水平分析。觀察到，與健康對照組相比，PD患者的PBMC中LCN2的表達明顯增加；但是，PPBP的mRNA水平下降（圖8B，C）。PROS1的表達水平相當(dāng)?shù)?，因此無法評估。此外，還從全血中提取了RNA，PROS1的表達在PD中明顯增加（圖8A），而LCN2和PPBP在組間沒有明顯差異。

圖8 PD患者和健康對照組的PROS1、PPBP和LCN2表達情況

05 - 在翻譯水平上對選定的差異分子進行驗證

????????對于ELISA，上述三個分子的血漿水平與mRNA表達一致。研究結(jié)果顯示，PD患者和健康對照組的外周血樣本中PPBP水平分別為1.770微克/毫升和2.269微克/毫升（圖9A）。與健康對照組相比，檢測結(jié)果顯示，PD患者血漿中PROS1和LCN2的濃度均有所提高（圖9B, C）。應(yīng)用接收操作特征（ROC）曲線來確定上述三種分子的診斷效果，發(fā)現(xiàn)PPBP、PROS1和LCN2的曲線下面積（AUC）分別為0.663、0.674和0.885（圖10A-C）。

圖9 PD患者和健康對照組的PPBP、PROS1和LCN2的血漿水平

圖10 PPBP、ROS1和LCN2的ROC曲線

四、結(jié)論

????????在這項研究中，作者利用基因表達數(shù)據(jù)集來識別DEGs，并通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和識別關(guān)鍵模塊發(fā)現(xiàn)了13個感興趣的基因。基于GO生物過程分析，PPBP、PROS1和LCN2參與了體液免疫反應(yīng)。盡管用Q-PCR和ELISA方法證明了PPBP、PROS1和LCN2在帕金森病患者和健康對照組中的統(tǒng)計學(xué)差異，但還需要進一步的調(diào)查，以便更深入地了解涉及這三種分子的外周體液免疫反應(yīng)對帕金森病潛在機制的影響。