導(dǎo)讀
Trends in Cell Biology (Cell系列綜述, 2018 IF: 18.564）于2018年6月1日在線發(fā)表了Steven Boeynaems（PhD Biomedical sciences, Stanford University School of Medicine, 一作兼通訊）撰寫的關(guān)于蛋白質(zhì)相位分離綜述一文《Protein Phase Separation: A New Phase in Cell Biology》。蛋白質(zhì)相變做為細(xì)胞區(qū)室形成和調(diào)節(jié)生化反應(yīng)的新思路而受到越來(lái)越多的關(guān)注，同時(shí)為神經(jīng)退行性疾病中無(wú)膜細(xì)胞器生物合成和蛋白質(zhì)聚集的研究提供了新的框架。該綜述中，總結(jié)了近年來(lái)無(wú)膜細(xì)胞器的研究現(xiàn)狀，相變的發(fā)生、發(fā)展、調(diào)控和在疾病治療中的應(yīng)用進(jìn)行了探討，并展望了未來(lái)幾年相變領(lǐng)域的主要問(wèn)題和挑戰(zhàn)。內(nèi)容豐富，見解前沿，值得相關(guān)領(lǐng)域的研究者細(xì)細(xì)品讀。
摘要
細(xì)胞區(qū)室和細(xì)胞器是組織生物物質(zhì)的基本形式。大多數(shù)熟知的細(xì)胞器通過(guò)膜結(jié)構(gòu)與周圍環(huán)境隔開。另外還有許多無(wú)膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器。最新研究表明這些無(wú)膜細(xì)胞器是蛋白質(zhì)和RNA的超分子組裝體，通過(guò)相位分離形成。近來(lái)研究揭示了無(wú)膜細(xì)胞器的分子特性、形成、調(diào)節(jié)和功能。細(xì)胞生物學(xué)、生物物理學(xué)、物理化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)的技術(shù)融合正幫助建立該新興領(lǐng)域--相變的分子調(diào)控原理，從而為找到治療與衰老相關(guān)疾病的新方法等重要發(fā)現(xiàn)鋪平道路。
Highlights
相位分離在多種細(xì)胞過(guò)程中起作用，包括形成經(jīng)典的無(wú)膜細(xì)胞器、信號(hào)復(fù)合物、細(xì)胞骨架和許多其他超分子組裝。
相位分離的概念為理解序列簡(jiǎn)并（低復(fù)雜性）和蛋白質(zhì)無(wú)序區(qū)域的功能提供了新的研究方向。
越來(lái)越多的證據(jù)表明，相變和無(wú)膜細(xì)胞器的失調(diào)在蛋白聚集相關(guān)的人類疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
理解蛋白質(zhì)相位分離背后的物理原理和分子互作機(jī)制可促進(jìn)新型生物材料的研發(fā)。
名詞解釋
凝膠 (Gel)：由大分子物質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵（化學(xué)凝膠）或非共價(jià)鍵（物理凝膠）彼此連接構(gòu)成的系統(tǒng)或液滴樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝膠的物質(zhì)屬性取決于分子間交聯(lián)的壽命、交聯(lián)的程度和模式 （交聯(lián)存在越久越傾向于固體，譯者注）。締合聚合物可形成物理凝膠，水溶性聚合物形成水凝膠。
內(nèi)部無(wú)序蛋白質(zhì)/區(qū)域 (Intrinsically disordered protein/ region)：包含多種空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或在其自然狀態(tài)下構(gòu)象可以快速變化的區(qū)域。（通常由重復(fù)序列或低復(fù)雜度序列組成，譯者注）
液體 (Liquid)：物質(zhì)的四個(gè)基本狀態(tài)之一，具有一定的體積但沒(méi)有固定的形狀。液體通常形成球形液滴使其表面積最小化以降低表面張力，且兩個(gè)液滴融合后仍為球形。在液體中，局部的空間秩序（主要是分子間距離和取向）不會(huì)超過(guò)鄰近幾個(gè)分子的尺寸，再遠(yuǎn)一些的分子都是隨機(jī)組織。這導(dǎo)致液體結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)快速重組并且還能夠與周圍環(huán)境進(jìn)行成分交換。
液晶 (Liquid–crystalline)：一種物質(zhì)狀態(tài)，同時(shí)具有液體和晶體的雙重性質(zhì)。組成液晶的分子以晶體樣形式組織，但也可以像液體一樣進(jìn)行流動(dòng)。液晶在分子尺度或至少在一個(gè)方向是有序的。液晶經(jīng)常會(huì)隨著溫度的變化發(fā)生相變。
液-液分層 (Liquid–liquid demixing)：兩種液體作為單獨(dú)的相共存而非混合溶液（參見相位分離）。
低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域（Low-complexity domain , LCD）：一種富含或僅由少數(shù)類型氨基酸組成的蛋白質(zhì)片段。這些片段的組合通常遵循簡(jiǎn)單模式，如串聯(lián)重復(fù)，并且與分子的快速進(jìn)化速率相關(guān)。
物質(zhì)狀態(tài) (Material state)：物質(zhì)可以產(chǎn)生的物質(zhì)狀態(tài)或相有四種：氣體、液體、固體和等離子體。
無(wú)膜細(xì)胞器 (Membraneless organelle)：沒(méi)有膜結(jié)構(gòu)限定的細(xì)胞區(qū)室。無(wú)膜細(xì)胞器通常由蛋白質(zhì)和核酸組成，呈現(xiàn)多種物質(zhì)狀態(tài)。
相位分離 (Phase separation)：相位分離反映了一種去混合的狀態(tài)變化 (demixing transition)，其中均勻且充分混合的溶液重新排列，使得不同的空間區(qū)域被不同濃度的物質(zhì)占據(jù)。在最簡(jiǎn)單情況如二元混合體系（聚合物和溶液）中，相位分離產(chǎn)生高濃度區(qū)域和低濃度區(qū)域。在Flory-Huggins溶解理論中，與二元混合物相關(guān)的混合自由能變量是二元物質(zhì)的作用參數(shù)（interdispersing term , x，原文單詞，譯者根據(jù)弗洛里－哈金斯溶液理論公式自主翻譯，參數(shù)x表示高分子和溶劑作用的參數(shù)）。如果物質(zhì)不互溶比低（x <0），則自由能低，組分將形成均勻的充分混合的溶液。如果物質(zhì)不互溶比高（x>0），則自由能高，會(huì)出現(xiàn)分層明顯的兩相。
相變 (Phase transition)：雖然相位分離是指初始均相溶液的分層，但相變描述了分子的相位或狀態(tài)轉(zhuǎn)變（例如，從液體到固體）。
固體 (Solid)：雖然液體和固體都被稱為凝聚態(tài)物質(zhì)，但它們的組分組織方式和動(dòng)力學(xué)系數(shù)不同。 無(wú)膜細(xì)胞器的物質(zhì)狀態(tài)可以是結(jié)晶的，半結(jié)晶的或液晶的，這取決于其空間有序性的程度和空間排序的定向性偏好。
1 介紹
Introduction
真核細(xì)胞由許多隔室或細(xì)胞器組成。這些細(xì)胞器負(fù)責(zé)執(zhí)行特定的生物學(xué)功能，對(duì)細(xì)胞組分、代謝過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)途徑起時(shí)空控制作用。例如，細(xì)胞核從物理上把轉(zhuǎn)錄與翻譯分開，這使得真核生物形成原核生物中大部分不存在的一套復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。其它有膜細(xì)胞器還有溶酶體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和突觸小泡。然而，細(xì)胞內(nèi)還有不少缺乏分界膜的細(xì)胞器，它們是由蛋白質(zhì)、核酸及其他分子組成的超分子組裝體，如細(xì)胞核中的核仁、核斑點(diǎn) (nuclear speckles)，以及細(xì)胞質(zhì)中的應(yīng)激顆粒stress granules (SGs)、加工小體（processing bodies，P-bodies）、中心粒 (centriole)。這些大部分胞體在幾十年前被發(fā)現(xiàn)，它們的結(jié)構(gòu)也逐漸被解析。然而，關(guān)于這些胞體是如何形成的、為何形成、有著怎樣的生理特征、如何促進(jìn)生物功能等問(wèn)題仍待探究。近年，跨學(xué)科研究手段的不斷進(jìn)步，推動(dòng)了對(duì)它們的組織，分子特性和分子機(jī)制的深入了解，以上問(wèn)題也開始得到解答。隨著對(duì)驅(qū)動(dòng)無(wú)膜細(xì)胞器形成的分子原理和理化動(dòng)力的日益了解，可以更清晰闡明它們?cè)诟鞣N細(xì)胞過(guò)程（如應(yīng)激反應(yīng)、基因表達(dá)調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）中的多種功能。在過(guò)去的幾年中，越來(lái)越多的證據(jù)表明無(wú)膜細(xì)胞器參與了衰老相關(guān)的疾病，如肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）。這些發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造了細(xì)胞生物學(xué)的新領(lǐng)域——專注于探索細(xì)胞物質(zhì)是如何組織成有特定功能的無(wú)膜細(xì)胞器以及它們的失調(diào)如何導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。
在這篇綜述中，我們探究了日漸火熱的無(wú)膜細(xì)胞器研究現(xiàn)狀，針對(duì)無(wú)膜細(xì)胞器相關(guān)的生物發(fā)生、組織結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)及調(diào)節(jié)機(jī)制和功能提出了自己的見解，同時(shí)討論了最近該領(lǐng)域的研究結(jié)果如何幫助我們解析衰老相關(guān)的疾病的分子機(jī)制，這可以為基于相位分離開發(fā)新型治療策略奠定基礎(chǔ)。最后，展望了未來(lái)的主要挑戰(zhàn)以及未來(lái)幾年需要解決的問(wèn)題。
2 無(wú)膜細(xì)胞器通過(guò)相位分離形成
Membraneless Organelles Are Formed via Phase Separation
許多無(wú)膜細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核區(qū)室例如，P-bodies，SGs (stress granules)，卵黃核 (the Balbiani body)，胚芽顆粒 (germ granules)，PML bodies，Cajal bodies，核斑點(diǎn)和核仁等已經(jīng)研究了很長(zhǎng)時(shí)間，然而，驅(qū)動(dòng)它們形成的機(jī)制大多仍是未知的 (enigmatic,elusive 是比unknown更高規(guī)格來(lái)表示未知的詞，適合多用，譯者注，更多英語(yǔ)寫作見https://mp.weixin.qq.com/s/37dMnfA6RTSybzkzKnambw)。一些早期研究強(qiáng)調(diào)了這些組件組裝的動(dòng)態(tài)特征。在2005年，有學(xué)者認(rèn)為Cajal bodies表現(xiàn)為“懸浮在半流體核質(zhì)中的半流體球”，然而，缺乏關(guān)于這些組件的物理性質(zhì)的確切實(shí)驗(yàn)證據(jù)。2009年，Brangwynne，Jülicher和Hyman證明P顆粒 (Pgranules)（秀麗隱桿線蟲胚胎中含有RNA和蛋白質(zhì)的胞體）具有類似液體的特性，并證明了它是通過(guò)相位分離形成。這是一種物理過(guò)程，過(guò)飽和的組分溶液自發(fā)分離成密相和稀相兩部分，然后穩(wěn)定共存。P顆粒的類液體性質(zhì)從它們的圓形外觀（使表面張力最小化的結(jié)果）、可變形性（熔合和裂變事件）及組分的動(dòng)態(tài)交換等特征中顯現(xiàn)出來(lái)的。在此后兩年，對(duì)核仁進(jìn)行了類似的觀察。液體本身不是“簡(jiǎn)單的液體”，而是一個(gè)具有特定含義的術(shù)語(yǔ)。“簡(jiǎn)單液體”，也稱為范德華流體，包含通過(guò)各向同性短程電位相互作用形成的球形顆粒。蛋白質(zhì)和RNA液相并不是均勻粘性的球形顆粒，它們更應(yīng)被描述為締合聚合物，并且由這種體系形成的液體具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)由物理交聯(lián)形成，從而具備一整套材料特性，包括空間組織液滴的可能性，其中一種聚合物潤(rùn)濕另一種聚合物。(Instead, they are best described as associative polymers and theliquids formed by such systems have distinctive structures that are defined byphysical crosslinks that give rise to a panoply of material properties,including the possibility of spatially organized droplets where one polymerwets another. 這一段不好翻譯，附上原文)
相位分離是聚合物化學(xué)中常見的現(xiàn)象，不過(guò)，它在生物大分子中的應(yīng)用是近期才出現(xiàn)的。前人研究發(fā)現(xiàn)，一些蛋白質(zhì)（如血紅蛋白），濃度高時(shí)在體外會(huì)發(fā)生相位分離，但這些結(jié)果的意義并不是很清楚。特別是晶體學(xué)家在結(jié)晶試驗(yàn)中經(jīng)常觀察到液-液相位分離。液滴形成降低了成核的自由能，因此是結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中可預(yù)期的現(xiàn)象。然而，關(guān)于相位分離可能是控制無(wú)膜細(xì)胞器形成，調(diào)控生物功能和活性的認(rèn)識(shí)是近幾年才產(chǎn)生的。Rosen及其同事在2012年就這一觀點(diǎn)提供了有力支持，他們發(fā)現(xiàn)含蛋白質(zhì)和含RNA的結(jié)構(gòu)可以從純化的成分中重建；并進(jìn)一步提供了證據(jù)表明這些重構(gòu)的液體胞體可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合物的成核。在這些開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)之后的幾年中，人們逐漸認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)和其他大分子（如RNA）可以形成充分混合或空間組織的凝聚物，并在不同的物質(zhì)狀態(tài)之間切換。無(wú)膜細(xì)胞器通常被稱為生物分子縮合物，并且遵循與其他聚合物相同的物理原理（Box 1）。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)支持這一過(guò)程中不同相變的多樣性以及背后復(fù)雜的分子和物理相互作用。
Box 1 方框1. 無(wú)膜細(xì)胞器可以是液體，固體或凝膠
無(wú)膜細(xì)胞器通常被稱為液體，但這種稱號(hào)會(huì)讓人聯(lián)想到熟知的液體而產(chǎn)生混淆。值得注意的是，所有液體，甚至是由硬球體構(gòu)成的所謂簡(jiǎn)單液體，都有明確定義的結(jié)構(gòu)，并可以根據(jù)對(duì)關(guān)聯(lián)函數(shù) (pair-correlation functions)進(jìn)行量化。這些函數(shù)表明，液體在長(zhǎng)度尺度上采用有序排列，而非晶體固體似的排列，其尺寸數(shù)量級(jí)為典型的分子尺寸。在較長(zhǎng)的尺度上，分子是隨機(jī)組織的，其組織方式使人聯(lián)想到稀釋氣體。非球形分子具有空間和方向順序，水和其他分子液體（包括聚合物）也是。局部空間排序和分子間取向受不同空間幅度和方向的層級(jí)互作影響，例如遠(yuǎn)程靜電，多極相互作用，氫鍵，力和涉及π（pi）-系統(tǒng)的短程相互作用。
在生物相位分離中，凝膠被認(rèn)為是固體的同義詞，凝膠化被認(rèn)為是從液體轉(zhuǎn)變?yōu)楣腆w的過(guò)程。凝膠由分子間互作的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)形成，可以通過(guò)其組成型大分子的連通性來(lái)貫穿凝膠。如果凝膠具有長(zhǎng)壽命的交聯(lián)和高密度的交聯(lián)，那么材料性質(zhì)可以與固體的性質(zhì)一致。相反，具有短壽命交聯(lián)和/或低密度交聯(lián)的凝膠將具有類似于液體的材料特性。
實(shí)際上，細(xì)胞器可以是液體、某種形式的固體、液體凝膠、固體凝膠、結(jié)晶固體、半結(jié)晶固體或液晶，這取決于空間排序的程度和排序的方向偏好。 為了給無(wú)膜細(xì)胞器合理的描述，必須至少測(cè)量以下5個(gè)指標(biāo)，即：（i）液滴中的大分子濃度，以量化密度；（ii）分子間長(zhǎng)程空間排序的程度，以量化液滴內(nèi)的分子間組織；（iii）分子間物理交聯(lián)的程度；（iv）液滴與其周圍環(huán)境之間的界面張力；（v）生成和破壞液滴內(nèi)鍵的時(shí)間尺度。 理想情況下，以上5種測(cè)量方式將分別對(duì)體外模擬的液滴和體內(nèi)活細(xì)胞中相同條件下的液滴進(jìn)行檢測(cè)，以揭示體內(nèi)外液滴的共性和差異。
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3 體內(nèi)外蛋白質(zhì)相位分離的分子決定因素
Molecular Determinants of Protein Phase Separation In Vitro and In Cells
蛋白質(zhì)組學(xué)和遺傳學(xué)研究已經(jīng)確定了幾種無(wú)膜細(xì)胞器的蛋白質(zhì)成分，這些研究表明，蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或線性基序 (adhesive domains and/or linear motifs) 的多價(jià)性 (multivalency)是驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)（或RNA分子）相變的關(guān)鍵。多價(jià)性可以通過(guò)以下三種方式中至少一種來(lái)實(shí)現(xiàn)：（i）具有特定互作界面的折疊蛋白質(zhì)可以形成寡聚體，進(jìn)而誘發(fā)相關(guān)元件的多價(jià)性 (associative patches)，并參與空間特異性互作; （ii）折疊結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)柔性接頭連接在一起產(chǎn)生線性多價(jià)蛋白質(zhì); （iii）內(nèi)部無(wú)序區(qū)域（IDRs）可以作為多個(gè)獨(dú)特的短線性基序的支架。當(dāng)然，多價(jià)性也可以通過(guò)以上提到的三種方式組合或通過(guò)諸如無(wú)序區(qū)域內(nèi)的結(jié)構(gòu)形成等應(yīng)激過(guò)程而出現(xiàn)。引起廣泛關(guān)注的一個(gè)特征是驅(qū)動(dòng)相變的蛋白質(zhì)中存在IDRs(intrinsically disordered regions) 。無(wú)序區(qū)域的序列具有構(gòu)象異質(zhì)性（即無(wú)固定結(jié)構(gòu)）被稱為內(nèi)部無(wú)序蛋白質(zhì)/區(qū)域（IDPs/ IDRs）。大多IDRs具有氨基酸組成偏好性且可能是重復(fù)序列，因此，這些IDRs的特定子集也稱為低復(fù)雜性域（LCDs）。富含IDRs / LCDs超分子組裝體的形成會(huì)促進(jìn)不同性質(zhì)的無(wú)膜細(xì)胞器的形成（圖1A-C）。一個(gè)典型的例子：IDRs、折疊結(jié)構(gòu)域和核酸之間不同分子相互作用產(chǎn)生了一系列組裝動(dòng)力學(xué)特征。例如，卵母細(xì)胞中的Balbiani bodies是由β折疊相互作用結(jié)合在一的類固體狀蛋白質(zhì)組裝；相反，許多RNA-蛋白（RNPs）顆粒是動(dòng)態(tài)和類液體狀的，并且遺傳實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明IDRs有助于它們的組裝；已知RNA結(jié)合蛋白（RBPs）具有多價(jià)模塊結(jié)構(gòu)域，在相位分離中的起著關(guān)鍵作用（Box 2）；通過(guò)柔性接頭連接的含有多個(gè)相互作用結(jié)構(gòu)域的工程蛋白在與其特定靶標(biāo)相互作用時(shí)表現(xiàn)出自發(fā)的液-液分層。這些數(shù)據(jù)表明，這種“fuzzy”作用模式可以實(shí)現(xiàn)多價(jià)互作功能域之間的多種組合，這可能是蛋白質(zhì)相變的通用驅(qū)動(dòng)因子（Box 3）。
（A.物質(zhì)狀態(tài)和動(dòng)態(tài)從液體到固體的廣泛變化； B. 蛋白質(zhì)FUS （漸凍人相關(guān)疾病蛋白）在體外可以具有所有的形態(tài)； C. 無(wú)膜細(xì)胞器機(jī)器體外重建實(shí)例；D.幾個(gè)無(wú)膜細(xì)胞器展示。它們具有復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包含可能屬于不同狀態(tài)的子隔室。生物AI插圖素材獲取和拼裝指導(dǎo)）
Box 2 方框2. 聚合物理論和多尺度模擬的見解
相變是一個(gè)協(xié)同轉(zhuǎn)換過(guò)程，涉及來(lái)自多價(jià)蛋白質(zhì)間相互作用模塊的集體效應(yīng)。這些多價(jià)蛋白可以進(jìn)行凝膠化，從而形成物理交聯(lián)的系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，其中交聯(lián)是相關(guān)結(jié)構(gòu)域/基序之間的非共價(jià)相互作用。蛋白質(zhì)聚合物也可以通過(guò)密度轉(zhuǎn)變縮合，從而形成與稀相共存的致密相。凝膠化的物理過(guò)程，更確切地說(shuō)是溶膠-凝膠的轉(zhuǎn)變，已被用于相關(guān)功能域/結(jié)合基序的效價(jià)對(duì)相變驅(qū)動(dòng)的影響。相比之下，密度轉(zhuǎn)變的物理特性解釋了形狀為球形的凝聚相的形成，并顯示出許多與液體相同的特性。實(shí)際上，兩種類型轉(zhuǎn)變的物理特征協(xié)同作用共同促成了無(wú)膜細(xì)胞器的形成，即更熟知的生物分子縮合物的形成。
多價(jià)蛋白質(zhì)是屬于締合聚合物的一類聚合物，它們可以通過(guò)相位分離或不經(jīng)相位分離實(shí)現(xiàn)凝膠化。這里，效價(jià)（valence）是指在分子內(nèi)部和分子間相互作用時(shí)互作的功能域/基序的有效數(shù)量。最近對(duì)締合聚合物理論的計(jì)算機(jī)模擬和調(diào)整表明，多價(jià)蛋白質(zhì)可以被解析成相關(guān)的結(jié)構(gòu)域/基序，即所謂互作功能域（stickers, 粘著劑），并由間隔序列 (spacers)穿插。粘著劑能夠?qū)崿F(xiàn)物理交聯(lián)，而間隔物 (spacers)或連接子 (linkers)決定是否通過(guò)相位分離驅(qū)動(dòng)凝膠化?？扇苄越宇^或間隔物抑制相位分離，而自締合性或?qū)θ芙夂徒Y(jié)合無(wú)偏好的接頭/間隔物將通過(guò)相位分離膠凝化。從理論，模擬和最近的實(shí)驗(yàn)中得出的關(guān)鍵結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)部無(wú)序區(qū)域 (intrinsically disordered regions) (相變的決定因素)和液滴內(nèi)蛋白質(zhì)模塊的密度和組織形式，是推動(dòng)相變的關(guān)鍵作用。
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除了僅用作連接子之外，IDRs還可以調(diào)節(jié)“粘性”互作以促進(jìn)相變。 McKnight及其同事發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，不同IDRs的濃縮液可以自發(fā)地形成水凝膠，類似于對(duì)含有FG-二氨基酸重復(fù)的核孔蛋白的觀察結(jié)果。此后不久，Taylor及其同事發(fā)現(xiàn)了hnRNPA1和hnRNPA2B1的IDRs中的疾病突變，可以促進(jìn)它們?cè)隗w外加速組裝成高級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)合體。此外，這些突變體促進(jìn)活細(xì)胞中SGs（應(yīng)激顆粒）的自發(fā)形成和動(dòng)力學(xué)顯著降低。幾個(gè)團(tuán)隊(duì)后續(xù)研究工作表明與疾病相關(guān)的IDRs蛋白質(zhì)如hnRNPA1或融合肉瘤基因（Fusedin Sarcoma, FUS）可以形成液滴。這些發(fā)現(xiàn)引起了整個(gè)領(lǐng)域?qū)DRs在相位分離中的重要性和功能性的關(guān)注，為真核生物中眾多的蛋白質(zhì)無(wú)序區(qū)域存在的合理性提供了又一理論依據(jù)。
Box 3 方框3. 異質(zhì)性對(duì)細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)的影響
核孔復(fù)合物在無(wú)序區(qū)域具有高頻率和弱相互作用的FG基序，但在FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) 實(shí)驗(yàn)中核孔復(fù)合物表現(xiàn)出較長(zhǎng)的恢復(fù)時(shí)間。需要考慮的是重復(fù)的基序或SLiM可能會(huì)產(chǎn)生一系列結(jié)合拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生大量的等能微觀狀態(tài)和更高的能量熵。這需要高度動(dòng)態(tài)的連接序列（例如，IDRs）來(lái)實(shí)現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)之間的最小化耦合并實(shí)現(xiàn)多種排列。此外，弱親和性的或非特異性的基序可以同時(shí)與多個(gè)靶位點(diǎn)相互作用，或甚至通過(guò)弱的短程作用與更多的配偶體結(jié)合。與一對(duì)一結(jié)合模型相反，陽(yáng)離子-π（pi），π-π（pi-pi），芳香氫鍵和范德華相互作用通過(guò)替代靶點(diǎn)在不同程度上誘發(fā)多價(jià)基序之間結(jié)合方式的不確定性。基于數(shù)學(xué)理論的計(jì)算模擬實(shí)驗(yàn)表明，與一對(duì)一結(jié)合模型相比，部分異構(gòu)交互可以將相界的形成難度降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。從這個(gè)方面來(lái)說(shuō)，高階組件類似于先驅(qū)絡(luò)合物 (encounter complex)，它們有助于基序間高效的互作，同時(shí)實(shí)現(xiàn)快速重組裝。這也意味著異質(zhì)系統(tǒng)可以在較低的效價(jià)下經(jīng)歷相變。通過(guò)很大數(shù)目的結(jié)構(gòu)狀態(tài)生成不同的冗余交互模式。盡管意外，構(gòu)象異質(zhì)性也可以通過(guò)熵效應(yīng)促進(jìn)組裝。這正與FUS組裝過(guò)程中觀察到的現(xiàn)象一致?？傊?，不只是組成蛋白的多價(jià)性，而且相互作用和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性也可能是無(wú)膜細(xì)胞器組裝和動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵決定因素。由于這種異質(zhì)性普遍存在于蛋白質(zhì)相互作用中，因此無(wú)膜細(xì)胞器相關(guān)的分子驅(qū)動(dòng)力可能與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)復(fù)合物和“低階”組裝沒(méi)有根本的區(qū)別。
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IDRs中的多價(jià)交互究竟是如何實(shí)現(xiàn)的？這些序列通常富含不帶電荷的極性側(cè)鏈（谷氨酰胺，天冬酰胺，甘氨酸，絲氨酸，脯氨酸），帶電荷的氨基酸（精氨酸，賴氨酸，谷氨酸，天冬氨酸）或芳香族殘基（苯丙氨酸和酪氨酸）。有趣的是，這些殘基似乎不是在整個(gè)序列中隨機(jī)分布的，而是常以短線性互作基序（short, linear interaction motifs, SLiM）、交互電荷塊或簡(jiǎn)并重復(fù)序列的形式存在。IDRs的序列偏好性表明它們可能具有一系列驅(qū)動(dòng)相變的作用力，可能包括靜電，偶極-偶極，π-π（pi-pi），陽(yáng)離子-π（pi），疏水和氫鍵相互作用等（圖2 A，B）。突變研究表明，改變多種殘基類型可以阻止不同LCDs的相位分離。此外，破壞交替電荷塊和重復(fù)序列中的關(guān)鍵氨基酸突變也會(huì)干擾相位分離。
無(wú)膜細(xì)胞器通常含有核酸，尤其是RNA。此外，與無(wú)膜細(xì)胞器相關(guān)的蛋白質(zhì)通常具有RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合基序，并且無(wú)膜細(xì)胞器中的RNA會(huì)促進(jìn)各種RBPs的相位分離（圖2C）。同時(shí)，若RNA/蛋白質(zhì)的化學(xué)計(jì)量比值 (stoichiometries)高，也會(huì)抑制相位分離。RNA還調(diào)節(jié)無(wú)膜細(xì)胞器的成核和時(shí)空分布。即便是參與葡萄糖代謝的由蛋白質(zhì)組成的G-bodies也需要借助RNA發(fā)揮生物活性。RNA也可以影響蛋白質(zhì)液滴的材料特性。最近發(fā)現(xiàn)重復(fù)排列的RNA通過(guò)分子間堿基配對(duì)相互作用發(fā)生相位分離，再一次突出了多價(jià)性和結(jié)構(gòu)多態(tài)性作為相位分離驅(qū)動(dòng)因子的普遍性。（2018年6月Richard Young教授在Science發(fā)表超級(jí)增強(qiáng)子結(jié)合的相變文章 Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control的，文章發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4和MED1可以在超級(jí)增強(qiáng)子處聚成液滴樣的核斑，并且該聚合可被化學(xué)處理干擾。BRD4和MED1的IDR（intrinsically disordered regions，IDRs）區(qū)可形成相位分離液滴，進(jìn)而區(qū)室化和富集轉(zhuǎn)錄機(jī)器，為超級(jí)增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在相變角度提供新的解釋。從Richard Young教授的系列研究看超級(jí)增強(qiáng)子發(fā)現(xiàn)背后的故事 (附超級(jí)增強(qiáng)子鑒定代碼)）
4 無(wú)膜細(xì)胞器的物質(zhì)形態(tài)：液體，水凝膠，團(tuán)簇
Material States of Membraneless Organelles: Liquids, Hydrogels, and Aggregates
盡管目前科研人員已經(jīng)對(duì)多種蛋白質(zhì)在試管中進(jìn)行了相位分離實(shí)驗(yàn)，但是目前關(guān)于體外或細(xì)胞內(nèi)與這些相位分離狀態(tài)相關(guān)的潛在分子機(jī)制還未達(dá)成共識(shí)。卵黃核 (Balbiani body)的相位分離依賴于穩(wěn)定的淀粉樣蛋白相互作用，而中心粒周物質(zhì) (pericentriolar material)和突觸后致密物(postsynaptic density)是由形成螺旋卷曲的蛋白質(zhì)之間的相互作用所介導(dǎo)。其它組裝的機(jī)制則不明朗。為了更好的理解應(yīng)激顆粒（SGs）的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，科學(xué)家投入了大量的精力。SGs的形成被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的一種形式——當(dāng)細(xì)胞受到壓力時(shí)SGs形成，但是是可逆的。Parker實(shí)驗(yàn)室最近的工作表明，僅基于試管實(shí)驗(yàn)來(lái)看，細(xì)胞中的情況可能遠(yuǎn)比我們想象的要復(fù)雜。SGs具有穩(wěn)定的核心，可以抵抗稀釋，這體現(xiàn)了SGs的非液體特性。盡管這一結(jié)果不能排除自發(fā)的相位分離和凝膠化相結(jié)合是形成SGs的路徑之一，但數(shù)據(jù)表明，SGs的分解可能是迫使物質(zhì)脫離kinetic traps的驅(qū)動(dòng)過(guò)程。事實(shí)上，超分辨率顯微鏡和交聯(lián)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了SGs具有不穩(wěn)定的液體外殼。這些結(jié)果指出了SGs有著復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，其他的無(wú)膜細(xì)胞器可能也是如此。
一些應(yīng)激顆粒（SG）蛋白的錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致例如肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）等神經(jīng)退行性疾病，并且突變型和野生型蛋白都會(huì)在神經(jīng)元中聚集。SGs是動(dòng)態(tài)組裝形成的，它們的聚集物可能具有原纖維結(jié)構(gòu)。 FUS和hnRNPA1是此類SG蛋白的實(shí)例，都具有長(zhǎng)的，低復(fù)雜性的蛋白質(zhì)區(qū)域，并且在ALS病人中發(fā)生了突變。McKnight及其同事的初步研究發(fā)現(xiàn)，這些無(wú)序的結(jié)構(gòu)域可以形成可逆轉(zhuǎn)的水凝膠，依賴于不穩(wěn)定扭曲的 β折疊。有趣的是，膠凝/溶解的重復(fù)循環(huán)促進(jìn)了水凝膠從可逆轉(zhuǎn)凝膠向不可逆轉(zhuǎn)凝膠的轉(zhuǎn)變。通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)FUS和hnRNPA1或低復(fù)雜性區(qū)域形成的液滴的研究人們提出了不同的假想機(jī)制。低復(fù)雜性蛋白質(zhì)區(qū)域在這樣的液滴中，似乎保持其無(wú)序的傾向，這與它們的單體狀態(tài)類似。然而，對(duì)于許多由低復(fù)雜性蛋白質(zhì)區(qū)域形成的液滴，特別是在含有全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的情況下，最終將發(fā)展為成熟纖維狀固體聚集體。并且，ALS引起的突變可以提高成熟率。兩種不穩(wěn)定的凝膠和液體向固體的轉(zhuǎn)變可以解釋ALS中SGs向聚集體的病理轉(zhuǎn)化，但它們與細(xì)胞SGs和聚集體的確切關(guān)系仍未確定。
5 特異性的產(chǎn)生與維持
How Is Specificity Generated and Maintained?
有趣的是，許多蛋白質(zhì)同時(shí)存在于多個(gè)不同的無(wú)膜細(xì)胞器中。由于這些蛋白質(zhì)在多價(jià)蛋白質(zhì)中顯著富集，因此不可避免地會(huì)出現(xiàn)什么決定了組裝的特異性和完整性的問(wèn)題：如何防止不同無(wú)膜細(xì)胞器的融合？如何維持無(wú)膜細(xì)胞器內(nèi)的不同子隔室？（例如在核仁中：圖1D）如何組裝和控制核仁等多相系統(tǒng)？最近的研究表明，蛋白質(zhì)液滴的表面張力差異可以介導(dǎo)這種多相液滴的形成。兩個(gè)亞核區(qū)室的關(guān)鍵組分可以獨(dú)立地發(fā)生相位分離，但所得的液滴具有不同的表面張力。當(dāng)混合在一起時(shí)，這些液滴不會(huì)融合，而是以液滴內(nèi)的液滴形式排列，這與核仁非常相似。這個(gè)例子揭示了一個(gè)更普遍的原則，可以作為解釋其他無(wú)膜細(xì)胞器中多相行為的理論基礎(chǔ)。
除了物理性質(zhì)之外，顆粒組裝的特異性可能源于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間直接互作的特異性。經(jīng)歷相位分離的IDPs和蛋白質(zhì)富含短線性互作基序（SLiM）和簡(jiǎn)并重復(fù)序列。它們都是蛋白-蛋白互作的主要參與區(qū)域 (圖2A，B）(生信寶典之傻瓜式(四)蛋白蛋白互作網(wǎng)絡(luò)在線搜索)。此外還可能與IDPs的其他特征有關(guān)，例如重復(fù)結(jié)合基序的數(shù)量和間隔（多價(jià)性），它們的翻譯后修飾（PTM）或中間接頭區(qū)域的動(dòng)態(tài)變化 。非特異性靜電相互作用，特別是與RNA的相互作用，對(duì)于液滴組裝成核至關(guān)重要。并且不同的IDRs對(duì)離子強(qiáng)度變化的響應(yīng)不同。盡管SLiMs具有一定程度的特異性，但多個(gè)SLiMs的加性效應(yīng)可能共同決定了相變形成的組裝復(fù)合體的物理特性和組成。
（A. 蛋白質(zhì)相位分離中觀察到的不同類型的接觸； B. 相位分離蛋白的實(shí)例說(shuō)明了多價(jià)性的重要性，高亮顯示蛋白內(nèi)的一系列互作模塊； C. 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相位分離的物質(zhì)狀態(tài)和形成凝集核的不同機(jī)制。 高顏值可定制在線作圖工具-第三版(操作更簡(jiǎn)單)）
另外，無(wú)膜細(xì)胞器中的幾種關(guān)鍵蛋白質(zhì)具有可折疊的二聚或寡聚結(jié)構(gòu)域。例如，G3BP1含有被SG(stress granules)靶向的可折疊二聚化結(jié)構(gòu)域。類似的例子還有PML、Cajal bodies和核斑點(diǎn) (nuclear speckles)。TDP-43可通過(guò)LCDs中的瞬變的α螺旋二聚化進(jìn)行相位分離，并且可以通過(guò)折疊的N末端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多聚化(圖2B)。這表明對(duì)于一些蛋白質(zhì)，相位分離可以通過(guò)兩種不同的機(jī)制發(fā)生。這兩種機(jī)制是通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生理的角度偶聯(lián)在一起的。Brangwynne實(shí)驗(yàn)室的工作為這種裝配機(jī)制提供了有說(shuō)服力的證據(jù)。Shin等人使用植物來(lái)源的光誘導(dǎo)蛋白寡聚化結(jié)構(gòu)域來(lái)提供驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的光遺傳學(xué)研究途徑。將該寡聚化結(jié)構(gòu)域融合到已知驅(qū)動(dòng)相位分離的LCDs產(chǎn)生的工程蛋白可在光刺激下在細(xì)胞中形成液滴。這些所謂的光液滴 (“optodroplets”)表明，特定的寡聚化結(jié)構(gòu)域與LCDs的組合確實(shí)是介導(dǎo)特定細(xì)胞相變的有效機(jī)制。寡聚化結(jié)構(gòu)域，卷曲螺旋 (colied-coils)和β-拉鏈 (β-zippers)可以提供驅(qū)動(dòng)無(wú)膜細(xì)胞器形成所需的倍增粘性互作(圖2B）。有趣的是，最近發(fā)現(xiàn)多種無(wú)序蛋白質(zhì)富含不穩(wěn)定的β-拉鏈區(qū)域，也就是推動(dòng)FUS凝膠化的區(qū)域。
很明顯，無(wú)膜細(xì)胞器和靶向細(xì)胞器的配體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分之間有明顯的區(qū)別。然而，區(qū)分這些行為的確切分子特征目前仍然未知。對(duì)于某些組裝體的偏好配體蛋白的選擇可以簡(jiǎn)單地由隔室的組件引入的物理限制來(lái)介導(dǎo) (Preference of client proteins for certain assemblies couldsimply be mediated by the physical restrictions introduced by the constituentcomponents of the compartment.)。蛋白質(zhì)液滴/凝膠中的相互作用陣列產(chǎn)生具有特定網(wǎng)格尺寸的網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)允許網(wǎng)格尺寸以下的小分子自由擴(kuò)散通過(guò)網(wǎng)絡(luò)，同限制較大分子的進(jìn)入，充當(dāng)擴(kuò)散屏障。另外，無(wú)膜細(xì)胞器可以錨定在空間中，從而防止擴(kuò)散和融合。例如，聚集體 (Aggresomes, aggregation of misfolded proteins)是由細(xì)胞骨架在核周的錯(cuò)誤折疊而形成的蛋白質(zhì)沉積物，這阻止了錯(cuò)誤蛋白在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散.
6 時(shí)空調(diào)節(jié)
Spatiotemporal Regulation
在試管中能自發(fā)進(jìn)行相位分離的蛋白知道的越來(lái)越多，但是細(xì)胞是如何對(duì)這一過(guò)程進(jìn)行精確控制的仍然令人費(fèi)解。例如，幾種RNA結(jié)合蛋白 (RBP) 在遠(yuǎn)高于其體外飽和濃度的細(xì)胞濃度下卻完全可溶，但是他們只在特定條件下發(fā)生相變。簡(jiǎn)而言之，細(xì)胞如何能夠避免自發(fā)和不可控的相位分離？這個(gè)問(wèn)題與前面提到的相變特異性起源的觀點(diǎn)密切相關(guān)。
不同實(shí)驗(yàn)室的工作都表明，絲氨酸和酪氨酸磷酸化、精氨酸甲基化和泛素化等都可以控制相位分離。重要的是，雙特異性激酶DYRK3的活性被證明是SG (stress granules)溶解所必需的，這表明可能存在控制這些過(guò)程的細(xì)胞開關(guān)。有趣的是，易于發(fā)生相位分離的蛋白質(zhì)似乎富含被翻譯后修飾（PTM）的殘基。實(shí)際上，蛋白的翻譯后修飾（PTM）可以顯著地改變這些IDRs/ LCDs的電荷或其他性質(zhì)，從而將序列固有驅(qū)動(dòng)力轉(zhuǎn)變?yōu)橄辔环蛛x(圖2C)。
細(xì)胞控制相變的另一種方法是控制細(xì)胞濃度和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分布（如介導(dǎo)相位分離的蛋白質(zhì)的散在分布）（圖2C）。hnRNPA1的細(xì)胞濃度高于其體外飽和濃度，但這些分子仍然可溶于細(xì)胞核的原因尚不清楚。阻斷hnRNPA1的核輸入，導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)中的積累，從而致使 SGs (stress granules)的自發(fā)形成。并且，核轉(zhuǎn)運(yùn)因子本身就是SGs的組成部分，說(shuō)明核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程可能會(huì)以多種未知的方式控制相位分離。
由于RNA參與形成多個(gè)無(wú)膜細(xì)胞器，特定RNA種類的存在與否也可以在特定時(shí)空層面調(diào)節(jié)相位分離（圖2C）。例如，非編碼NEAT-1 RNA的表達(dá)對(duì)于散斑 (para-speckle)的形成是必需的。此外，細(xì)胞應(yīng)激下的多聚核糖體解離促使細(xì)胞質(zhì)包含更多游離mRNA，隨后使SG (stress granules)成核。正常狀態(tài)或應(yīng)激響應(yīng)被激活時(shí)，抑制多聚核糖體的解離都可以阻止SG的形成。此外，經(jīng)典的應(yīng)激顆粒標(biāo)記物poly（A）結(jié)合蛋白（PAB1）在響應(yīng)熱應(yīng)激時(shí)會(huì)發(fā)生相位分離，釋放其結(jié)合的RNA。這表明翻譯響應(yīng)和SG形成之間存在復(fù)雜的關(guān)系。
7 疾病、病理及衰老
Disease, Pathology, and Aging
一些在神經(jīng)退行性疾病中的關(guān)鍵蛋白是無(wú)膜細(xì)胞器的組件，因而這些組件的裝配在形成、維持或清除過(guò)程中發(fā)生某些錯(cuò)誤的調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致病態(tài)聚合的形成。事實(shí)上在試管和細(xì)胞中持續(xù)數(shù)小時(shí)的觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)蛋白液滴及水凝膠會(huì)自發(fā)成熟化，形成固態(tài)聚合。此轉(zhuǎn)換表明這種動(dòng)態(tài)的裝配可能具有亞穩(wěn)定性或天然不穩(wěn)定性，并且特定的細(xì)胞過(guò)程可阻止這種固化過(guò)程的發(fā)生(Figure 2C)。這種從液體到固體的相變可被疾病相關(guān)突變所促進(jìn)，表明相變（phase transition）對(duì)于病理研究的重要性。這些疾病突變似乎靶向存在于內(nèi)在無(wú)序區(qū)（intrinsically disordered regions，IDRs）的β拉鏈結(jié)構(gòu)域，使其更加傾向于折疊為穩(wěn)定的淀粉樣結(jié)構(gòu)。值得注意的是，目前還沒(méi)有直接的證據(jù)表明在病人的大腦中，病態(tài)的蛋白質(zhì)聚集是由應(yīng)激顆粒(stress granules, SGs)或其他無(wú)膜細(xì)胞器的凝固化造成的。
疾病突變也可能通過(guò)產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)和RNA種類來(lái)影響相位分離。在這方面，重復(fù)序列擴(kuò)增導(dǎo)致的功能異常尤其有趣。其中的一些異常包括重復(fù)RNA位點(diǎn)的形成，后者可捕獲RNA結(jié)合蛋白，導(dǎo)致其功能喪失。有趣的是，這種RNA重復(fù)序列自身可通過(guò)多堿基配對(duì)進(jìn)行相位分離，與病人體內(nèi)觀察到的現(xiàn)象一致。此外，一些RNA重復(fù)序列可翻譯并產(chǎn)生有重復(fù)序列的多肽。例如，引發(fā)肌萎縮側(cè)索硬化癥的GGGGCC序列重復(fù)可產(chǎn)生不同的二肽重復(fù)序列。其中的兩個(gè)被稱為甘氨酸——精氨酸、脯氨酸——精氨酸的二肽重復(fù)序列，定位于不同的無(wú)膜細(xì)胞器，包括應(yīng)激顆粒體（SGs）。包含這些致病肽段的SGs (stressgranules)有較小的動(dòng)態(tài)性，而且還招募了一些易于產(chǎn)生聚集的蛋白質(zhì)，如TDP-43。
SGs (stress granules)的清除依賴于自噬。自噬基因的突變是導(dǎo)致各種疾病的原因，包括肌萎縮側(cè)索硬化。另外自噬作用也隨著年齡的增長(zhǎng)而變?nèi)?。除了自噬之外，分子伴侶也都參與了保持SG (stress granules)的易變性和可清除性。這些觀察結(jié)果表明，細(xì)胞若無(wú)法對(duì)這些程序進(jìn)行嚴(yán)格控制可能導(dǎo)致病理聚合。核轉(zhuǎn)運(yùn)也因年齡老化而衰退，并且越來(lái)越多地被發(fā)現(xiàn)參與到蛋白質(zhì)聚集引起的疾病中。
線粒體功能紊亂是衰老和神經(jīng)退化的基礎(chǔ)，因其可能會(huì)導(dǎo)致ATP水平下降，從而影響無(wú)膜細(xì)胞器的調(diào)節(jié)。大量的SG (stress granules)蛋白含有ATP酶結(jié)構(gòu)域，并且降低細(xì)胞的ATP水平會(huì)降低細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)特性。另外，有證據(jù)表明，細(xì)胞ATP可以作為化學(xué)助溶物直接阻止相位分離和聚合。ATP的這個(gè)特征獨(dú)立于它在激活細(xì)胞進(jìn)程中提供能量的作用。因此在老化和疾病中，線粒體呼吸功能的缺陷可能促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集，要么通過(guò)整體地減少細(xì)胞ATP水平，要么是由于依賴ATP的可維持無(wú)膜細(xì)胞器流動(dòng)性的生物通路的損傷導(dǎo)致的。
蛋白翻譯后修飾（PTMs）在相位分離調(diào)節(jié)中具有重要作用，并且值得注意的是，一些病理蛋白質(zhì)聚集顯示了特定的PTM特征。例如，Tau磷酸化（Tau phosphorylation）是阿爾茨海默?。ˋLS）病理的一個(gè)標(biāo)志。有趣的是，tau磷酸化促進(jìn)了體外的聚合和相位分離。
盡管蛋白質(zhì)聚集和相變大多是在神經(jīng)退行性疾病的背景下進(jìn)行研究的，但它們與各種各樣的病理?xiàng)l件有關(guān)，包括病毒感染和癌癥。與神經(jīng)退化相關(guān)的一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)也與不同類型的癌癥有關(guān)聯(lián)。例如，在ALS中參與應(yīng)激顆粒 (SG)靶向和聚合的FUS蛋白（一個(gè)RNA結(jié)合蛋白）的低復(fù)雜域（low-complexity domains, LCD）已被證明在脂肪肉瘤中發(fā)生了致癌融合。事實(shí)上，癌癥相關(guān)的融合蛋白通常富含無(wú)序的低復(fù)雜性功能域，表明這可能是一種常見的機(jī)制。FUS蛋白的低復(fù)雜區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活潛力，以及它的人類同源物EWSR1和TAF15蛋白（三者在一個(gè)癌癥家族中有關(guān)聯(lián)）的轉(zhuǎn)錄激活潛力，與它們?cè)隗w外的水凝膠結(jié)合能力以及招募聚合酶II的C端區(qū)域到所在水凝膠的能力高度相關(guān)。FUS蛋白的低復(fù)雜域和它的同源基因介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活的機(jī)制雖然還不清楚，但被認(rèn)為是與相位分離過(guò)程有關(guān)的。此外，增加的SG (stress granules)和旁斑（paraspeckle）的形成與癌癥存活的預(yù)后率低有關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑制基因p53的聚合導(dǎo)致其功能喪失，是癌癥的主要機(jī)制，而阻止其聚合的化合物在臨床前動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中取得了成功。（生信寶典之傻瓜式(六)查找轉(zhuǎn)錄因子的靶基因）
SGs也參與到抗病毒的應(yīng)激反應(yīng)中，并且病毒已經(jīng)進(jìn)化出了許多干擾SG裝配的方法。此外，一些病毒，如蟲媒病毒 (flaviviruses)，包括寨卡病毒，甚至劫持了SG蛋白來(lái)輔助自身的復(fù)制。盡管還處于起步階段，但由于蛋白質(zhì)聚集和相位分離與許多人類病理狀態(tài)相關(guān)，因此更好地理解這些過(guò)程將幫助在更廣闊的人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展新的治療策略。
8 通向新的治療途徑
Road Toward Novel Therapy?
如前所述，我們提出蛋白質(zhì)相位分離與病理蛋白聚集和疾病密切相關(guān)的假說(shuō)。但只有在徹底理解了背后的調(diào)控機(jī)制并研發(fā)出新的疾病治療方式后，才能說(shuō)明該假說(shuō)的成立。細(xì)胞的相變可以被干擾疏水或極性相互作用的不同化學(xué)物質(zhì)所調(diào)控。然而，這種非定向化合物可以靶向細(xì)胞中的大部分無(wú)膜細(xì)胞器，可能并不是疾病治療的最佳選擇。
反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASOs)提供了一個(gè)可能合適的可選方法，可特異性地敲低異常相變中的關(guān)鍵參與者。雖然針對(duì)病理蛋白的ASOs在不同的小鼠模型中取得了成功，但其應(yīng)用僅限于非致死性(non-essential)蛋白。對(duì)于致死性蛋白，ASOs可以靶向其非致死性的功能分子伴侶，進(jìn)而調(diào)節(jié)相變。以ALS模型中致死性蛋白TDP-43為例說(shuō)明該方法的可行性。Ataxin-2已在動(dòng)物模型和人中被確認(rèn)為是ALS疾病的調(diào)節(jié)因子。隨后的研究表明，Ataxin-2直接招募TDP-43到SGs，這為它促進(jìn)TDP-43的聚集提供了一種機(jī)制解釋。與TDP-43敲低不同，Ataxin-2的敲低（KD）在小鼠中耐受良好。確信的是，ALS小鼠模型中敲低Ataxin-2降低了小鼠脊髓中TDP-43聚集物的數(shù)量，顯著延長(zhǎng)了存活率。類似的，敲低與Tau相互作用的SG蛋白Tia-1可在培養(yǎng)的神經(jīng)元和嚙齒動(dòng)物模型中抑制Tau病理和毒性。這些研究充分表明，通過(guò)ASO技術(shù)靶向相變是阻止TDP-43和Tau蛋白病理性聚集的可行策略，也可能適用于其他蛋白聚集性疾病的治療。（R語(yǔ)言學(xué)習(xí) - 非參數(shù)法生存分析）
最后，考慮到蛋白質(zhì)的聚集和相位分離受到細(xì)胞蛋白質(zhì)降解及分子伴侶機(jī)制的嚴(yán)格控制，目前的工作重點(diǎn)是尋找能上調(diào)這些通路的藥物，或產(chǎn)生能拮抗病理相變的強(qiáng)效工程學(xué)解聚分子。闡明蛋白的相位分離的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制將是識(shí)別新通路的關(guān)鍵，進(jìn)而靶向新通路矯正病理性相變。
9 結(jié)束語(yǔ)
Concluding Remarks
近年來(lái)，關(guān)于大量細(xì)胞器是通過(guò)相位分離形成的認(rèn)識(shí)越來(lái)越清晰。雖然這些細(xì)胞器已經(jīng)被研究了幾十年(或者如核仁，已經(jīng)研究了一個(gè)多世紀(jì))，但它們的動(dòng)態(tài)性質(zhì)及這種動(dòng)態(tài)性與無(wú)膜細(xì)胞器的形成、功能和生理病理的關(guān)系直到最近才被揭示。利用聚合化學(xué)的先進(jìn)技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在快速發(fā)展的細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域中，對(duì)無(wú)膜細(xì)胞器的認(rèn)識(shí)有了顯著的提高，并開發(fā)了進(jìn)一步探索其潛在生物物理學(xué)行為機(jī)制的新方法。毋庸置疑，這些新發(fā)現(xiàn)已經(jīng)為靶向人類疾病發(fā)生中的異常蛋白相變提供了新的思路。此外，了解序列和所產(chǎn)生的物質(zhì)狀態(tài)之間的關(guān)系也可能促進(jìn)產(chǎn)生新的合成生物學(xué)材料。
然而我們必須充分意識(shí)到，我們還遠(yuǎn)未完全了解無(wú)膜細(xì)胞器背后的復(fù)雜生物學(xué)機(jī)制以及它們的功能與作用。為此列出了我們認(rèn)為仍未解決的關(guān)鍵問(wèn)題(見OutstandingQuestions)清單。解決這些問(wèn)題對(duì)于進(jìn)一步深入了解蛋白質(zhì)的相位分離是至關(guān)重要的。開發(fā)新的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)工具是完成這個(gè)目標(biāo)所必須的。目前，無(wú)膜細(xì)胞器的純化和高分辨率結(jié)構(gòu)研究仍是一個(gè)瓶頸，特別是在活體細(xì)胞環(huán)境中。只有開發(fā)出特異性地靶向單個(gè)顆粒體的工具，我們才能將這些顆粒體用于新的疾病治療，并將我們的基本生物學(xué)知識(shí)應(yīng)用于臨床。蛋白質(zhì)的相位分離還沒(méi)有展示出其所有的奧秘，一個(gè)令人興奮的未來(lái)即將到來(lái)。
Box 4 方框4. 無(wú)膜細(xì)胞器的功能是什么？
許多蛋白質(zhì)似乎已經(jīng)進(jìn)化出驅(qū)動(dòng)無(wú)膜細(xì)胞器形成或被募集到無(wú)膜細(xì)胞器的能力。然而為什么細(xì)胞需要這樣的結(jié)構(gòu)？他們的生化功能是什么？令人驚訝的是，這些問(wèn)題基本上沒(méi)有答案。
不同形式和尺度的區(qū)室劃分在生物體廣泛存在。 我們的胃是一個(gè)功能確定的器官，它只有一個(gè)主要目的，即通過(guò)酸水解消化食物。顯然，如果身體能把食物和酸都集中到一個(gè)單獨(dú)隔室中，化學(xué)反應(yīng)進(jìn)展更順暢。 另外，這種區(qū)室可以保護(hù)其他器官免暴露于酸環(huán)境中。 同樣，我們的細(xì)胞也進(jìn)化出一種驚人相似的機(jī)制，如溶酶體產(chǎn)生酸性隔室以降解細(xì)胞廢物。 通過(guò)膜屏障，溶酶體可以濃縮反應(yīng)組分，同時(shí)保護(hù)細(xì)胞的其余部分免受傷害。器官-細(xì)胞器水平相對(duì)應(yīng)的另一個(gè)例子是脂肪組織和脂滴，他們以脂質(zhì)的形式儲(chǔ)存能量供以后使用。 此外，身體和細(xì)胞可以通過(guò)區(qū)室化信號(hào)接收放大來(lái)自環(huán)境的信號(hào)：眼睛將入射光聚焦到富含光接收器的視網(wǎng)膜上。在亞細(xì)胞水平上，神經(jīng)元也將它們的受體集中在不同的子結(jié)構(gòu)中，即突觸。
從以上類比中，可發(fā)現(xiàn)區(qū)室化的四個(gè)主要功能，即：（i）濃縮(生)化反應(yīng)的成份；（ii）隔離有害成分；（iii）生物分子的儲(chǔ)存；（iv）信號(hào)放大。有趣的是，所有這些功能都存在于無(wú)膜細(xì)胞器領(lǐng)域。首先，通過(guò)相位分離濃縮細(xì)胞骨架組分促進(jìn)它們成核變?yōu)榻z狀物，并且類似地，剪接也是通過(guò)mRNA上的剪接因子的多價(jià)組裝來(lái)控制的。其次，雖然疾病中的蛋白質(zhì)聚集體被認(rèn)為是有害的，但越來(lái)越多的證據(jù)表明它們也可能是細(xì)胞最初的拯救機(jī)制--隔離毒性更高的蛋白質(zhì)寡聚體。第三，許多組件起到儲(chǔ)存顆粒的作用，因?yàn)樗鼈冊(cè)诿鎸?duì)應(yīng)激或靜息狀態(tài)時(shí)可隔離蛋白質(zhì)和其他生物分子，以便以后再次使用。第四，通過(guò)濃縮受體和信號(hào)分子，細(xì)胞可以放大某些信號(hào)傳導(dǎo)途徑。鑒于此，不同的膜受體可通過(guò)蛋白質(zhì)相位分離實(shí)現(xiàn)這個(gè)功能。
雖然我們還沒(méi)有完全揭示細(xì)胞中相位分離的復(fù)雜功能，但這些例子讓我們大致了解了為什么細(xì)胞可以受益于無(wú)膜細(xì)胞器的形成。
教育部推出首批490門“國(guó)家精品在線開放課程”
蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、可視化、分子對(duì)接簡(jiǎn)明教程 1-4系列
10 重點(diǎn)問(wèn)題
Outstanding Questions
相位分離確切的生物學(xué)功能是什么？為什么細(xì)胞會(huì)進(jìn)化產(chǎn)生無(wú)膜細(xì)胞器？是什么讓液體/凝膠組成在功能上與經(jīng)典蛋白質(zhì)復(fù)合物不同？
我們對(duì)驅(qū)動(dòng)相位分離的物理動(dòng)力有了基本的了解，但在原子水平對(duì)互作的的深入了解會(huì)幫助更好地理解這些相變的機(jī)制。
不同無(wú)膜細(xì)胞器的必須和非必須組成部分是什么，它們的序列和結(jié)構(gòu)特性是什么？
盡管有一些例子，但我們對(duì)細(xì)胞中相位分離的時(shí)空調(diào)節(jié)機(jī)制知之甚少。這將是理解生物學(xué)如何調(diào)節(jié)物理學(xué)的關(guān)鍵。涉及哪些調(diào)控通路？
目前無(wú)膜細(xì)胞器組成的特異性程度的認(rèn)知和預(yù)測(cè)完全不清楚。如什么介導(dǎo)蛋白質(zhì)和RNA形成特定相，以及什么阻止了不同的無(wú)膜細(xì)胞器的聚結(jié)？
雖然在體外試管中確定胞體顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面取得了一些進(jìn)展，但缺乏在活細(xì)胞中研究該問(wèn)題的工具。即如何在體內(nèi)研究無(wú)膜細(xì)胞器的內(nèi)部組織？
生理和病理組裝有什么區(qū)別？哪些因子驅(qū)動(dòng)病變？
疾病突變和衰老如何特異性地影響無(wú)膜細(xì)胞器成分的相位分離？相關(guān)的分子事件有哪些？
為什么與蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的疾病會(huì)顯示出如此明顯的細(xì)胞類型特異性？什么使（特定）神經(jīng)元對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的干擾特別敏感？
原文：Protein Phase Separation: A NewPhase in Cell Biology
翻譯：凌路頔 劉晉蕓 宋紅衛(wèi)
文章原文: http://blog.genesino.com/2018/08/phase/
