單細胞RNA測序(scRNA-seq)

單細胞RNA測序(scRNA-seq)是剖析細胞間分子異質(zhì)性的有力工具。目前，大多數(shù)scRNA-seq方法涉及組織解離和隨機條形碼，有時借助熒光激活細胞分選(FACS)來純化感興趣的細胞。懸浮液中的單細胞隨后使用微流體裝置如Chromium Controller (10× Genomics)進行測序。這些方法特別適合于以無偏見的方式描繪大量細胞，隨后進行生物信息學分析以定義細胞類型分類學。

10月16日， Neuron 以 “Deep scRNA sequencing reveals a broadly applicable Regeneration Classifier and implicates antioxidant response in corticospinal axon regeneration” 為題發(fā)表了一篇來自加州大學圣地亞哥分校醫(yī)學院Binhai Zheng教授團隊的研究論文，研究人員利用單細胞 RNA 測序確定了一種新的再生調(diào)節(jié)劑的生物標志物，并導致再生分類器的開發(fā)，從而使該分類器可廣泛應用于基于單細胞轉(zhuǎn)錄組的預測不同神經(jīng)元群體的再生潛力。

作者重點研究了皮質(zhì)脊髓束（CST）的神經(jīng)元，首先用PTEN和SOCS3共缺失來誘導CST再生，因為它們的共缺失先前已顯示協(xié)同促進RGCs和CST神經(jīng)元的軸突生長(再生或發(fā)芽)，同時為了區(qū)別標記再生與非再生CST神經(jīng)元，研究人員應用了兩種不同的逆行病毒示蹤劑:一種在脊髓背側(cè)半切損傷之前，另一種在損傷之后，從而使研究人員后期能夠比較再生神經(jīng)元和非再生神經(jīng)元的測序數(shù)據(jù)。

圖1：A手術(shù)時間表。B脊髓背側(cè)半切傷

接著，研究人員使用膜片吸管從29個PTENfl/fl的急性腦切片中收集326個CST神經(jīng)元(123個再生，203個非再生)的細胞質(zhì)物質(zhì)，然后對單細胞進行了深度測序，即每個細胞測序 500 萬個讀數(shù)，以 100 萬個讀數(shù)對唯一映射到外顯子，這是 10× Genomics 數(shù)據(jù)深度的 100 倍。之后，研究人員使用單細胞方法(Seurat、Garnett和SingleR)和批量RNA-seq方法(DESeq2、EdgeR)來分析這些高深度高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

圖2：皮質(zhì)脊髓神經(jīng)元的單細胞聚類分析

圖3.?將再生分類器應用于不同發(fā)育階段的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs ),揭示了出生后早期RGCs內(nèi)在軸突生長能力急劇下降的轉(zhuǎn)錄組學基礎(chǔ)

圖4.?將再生分類器應用于公開的scRNA-seq數(shù)據(jù)產(chǎn)生細胞類型和發(fā)育階段合適的分類

圖5.?差異表達基因的生物信息學分析NFE2L2和PPARGC1A作為基因網(wǎng)絡的兩個中心樞紐

研究小組發(fā)現(xiàn)，除少數(shù)例外情況外，再生分類器成功地預測了單個神經(jīng)元的再生潛能，并能重現(xiàn)先前研究的已知趨勢，如神經(jīng)元的再生能力在出生后急劇下降。因此，高深度、低通量的scRNA-seq方法在區(qū)分轉(zhuǎn)錄相似的神經(jīng)元亞型甚至狀態(tài)方面具有獨特的優(yōu)勢。在這項研究中，再生和非再生CST神經(jīng)元之間的差異基因表達反映了不同的再生狀態(tài)，而不是神經(jīng)元亞型。進一步闡明高深度、低通量的scRNA-seq方法將繼續(xù)補充低深度、高通量方法，以了解新的生物學。

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