illumina平臺雜交捕獲流程介紹

NGS流程（以Nanodigmbio的雜交捕獲方案為例）

NGS流程圖

建庫原理介紹

建議此部分可以參考一些文獻(xiàn)及商品化試劑盒進(jìn)行了解

片段化

DNA片段化主要是通過物理方法（如超聲打斷，霧化等）或酶學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)的
-超聲法可以得到比酶切法更窄的DNA片段分布，酶切法雖不如超聲打斷集中，但是操作過程更經(jīng)濟(jì)便捷，且損失的樣本更低。
-一般來說，對于裸露的DNA進(jìn)行片段化不易引起較大的偏倚，但是需要注意的是，CHIP seq中，染色質(zhì)的超聲打斷具有偏好性，也即常染色質(zhì)比異染色質(zhì)更容易被超聲剪切。
-酶切法有一定的偏好性（容易切割A(yù)T），因此酶切法制備的片段化文庫可能會存在GC含量輕度升高，以及形成扔造成的插入及缺失。

1.超聲打斷

-Covaris樣品制備是基于專利的Adaptive Focused Acoustic（AFA）技術(shù)。它利用幾何聚焦聲波能量，通過>400kHz的球面固態(tài)超聲傳感器將波長為1mm的聲波能量聚焦在樣品上。這個(gè)過程是在等溫的條件下進(jìn)行的，配合專門設(shè)計(jì)的AFA管，Covaris儀器可精確地將DNA和RNA打斷成100-1500 bp片段（microTUBE），或2-5 kb片段（miniTUBE）。對于那些需要更長DNA片段的測序應(yīng)用，Covaris還開發(fā)出專利的g-TUBE。這種管通過離心產(chǎn)生剪切力，能產(chǎn)生6-20 kb的片段。

2.酶切法打斷

• DNase I（Deoxyribonuclease I）：中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5'端為磷酸基團(tuán)，3'端為羥基。DNase Ⅰ酶切底物DNA通常依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活，在鎂離子存在條件下，DNase I隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價(jià)錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。DNase Ⅰ在不同的離子存在下可以片段化dsDNA，然后實(shí)際操作中卻易受到多種條件的影響，如酶的用量，反應(yīng)溫度，底物DNA的純度等。此外研究發(fā)現(xiàn)DNase Ⅰ對嘧啶核苷酸旁邊位點(diǎn)有偏好性，大大影響終文庫的多樣性。
• 核酸內(nèi)切酶 V 是在E. coli 中發(fā)現(xiàn)的一種 DNA 修復(fù)酶。其識別脫氧肌苷（脫氧腺苷在DNA中的脫氨基產(chǎn)物），對錯(cuò)配的脫氧肌苷3′ 端第二個(gè)磷酸二酯鍵進(jìn)行切割，產(chǎn)生一個(gè) 3′ 羥基、5′ 磷酸的切刻。除此之外在較小程度上可以識別AP位點(diǎn)，基因錯(cuò)配的DNA位點(diǎn)，插入/缺失不匹配等位點(diǎn)。
• dsDNA fragmentase：以NEBNext dsDNA fragmentase為例，其實(shí)為兩種酶的混合物（創(chuàng)傷弧菌核酸酶突變蛋白質(zhì)，T7核酸內(nèi)切酶突變蛋白質(zhì)），前者在dsDNA雙鏈上隨機(jī)制造缺口，后者則會在缺口處剪開互補(bǔ)鏈，造成雙鏈斷裂。
• 轉(zhuǎn)座酶：Illumina的Nextera技術(shù)，利用一種轉(zhuǎn)座酶能同時(shí)完成DNA片段化和接頭的添加，從而減少樣品處理，并節(jié)約時(shí)間。據(jù)了解，利用Nextera DNA樣品制備試劑盒，測序即用型文庫可在90分鐘內(nèi)產(chǎn)生，且手動操作僅需15分鐘。

末端修復(fù)加A

1. 原理

• 打斷后的DNA片段，需要修復(fù)DNA鏈中存在的缺口，處理片段兩端的粘性末端（3’端切除，5’端補(bǔ)平），隨后對雙鏈的5’端進(jìn)行磷酸化。
• 由于酶均為蛋白質(zhì)，保存buffer主要成分含tris-HCl，BSA，NaCl，KCl，MgCl2，DTT，甘油等，tris主要用于穩(wěn)定pH，DTT則具有強(qiáng)還原性可以用于保護(hù)蛋白中的巰基，BSA可以提高酶活性，高濃度鹽粒子主要用于中和核酸骨架的負(fù)電荷，Mg2+則是因?yàn)槠涫遣糠置傅募っ浮?/li>

2.組分

文獻(xiàn)1 末端修復(fù)體系

文獻(xiàn)1 加A體系

1. Klenow fragment：最適溫度37℃，其5’→3’ DNA聚合酶活性用于5’凹端的補(bǔ)平，5’→3’外切酶活性用于5’凸端的切除。
2. T4 DNA ligase：最適溫度16-20℃，用于修復(fù)DNA鏈中缺口磷酸二酯鍵
3. T4 PNK：最適溫度37℃，催化NTP的γ為磷酸向DNA，RNA及oligo的5’-OH進(jìn)行轉(zhuǎn)移，主要用于DNA fragment 5’末端磷酸化，進(jìn)而與3’-OH形成磷酸二酯鍵。
4. Taq DNA polymerase：最適溫度約65℃，TaqDNA聚合酶具有5’→3’ DNA聚合酶活性及5’→3’外切酶活性，而并沒有3’→5’外切酶校正活性（需要注意的事高保真taq聚合酶具有3’→5’外切酶校正活性）
5. dATP：用于3’末端加A

接頭連接

接頭的分類

• 根據(jù)Index位置可以將接頭分為單端Index接頭和雙端Index接頭。單端Index接頭指的是僅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端），雙端Index接頭指的在P5和P7端均存在Index。

  
  
  IDT TSHT 單端index接頭
  
  
  IDT UDI 雙端唯一index接頭
  
  
  IDT xGen? Dual Index with UMI 3合1接頭
  
  
  IDT xGen? Duplex Seq Adapters 雙端UMI

• 根據(jù)接頭是否匹配PCR free建庫可以將接頭分為長接頭（圖4，圖5，圖6）和短接頭（圖7）。長接頭又稱為完整接頭，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接頭通過TA克隆的方式連接到DNA片段之后，可不進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)直接上機(jī)測序（DNA量足夠上機(jī)測序時(shí)可直接上機(jī)，當(dāng)DNA量不夠時(shí)還需進(jìn)行PCR擴(kuò)增使得產(chǎn)物達(dá)到一定的量方可上機(jī)測序）。短接頭通過TA克隆方式連接到DNA片段上后，必須與短接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物就是包含完整接頭的DNA片段。也即短接頭最終一定要通過PCR擴(kuò)增成為完整接頭才能上機(jī)測序。

  
  
  illumina Y型接頭
  
  
  MGI泡狀接頭

連接過程

連接原理

主要利用連接酶，在AT接頭配對以后，連接接頭與DNA片段之間的磷酸二酯鍵，一般連接buffer主要成分為高濃度鹽粒子及PEG，其中高濃度鹽粒子左右為中和磷酸骨架的負(fù)電荷，使得核酸容易聚集，而PEG可以奪取核酸骨架的水分子，促使核酸分子聚集，另外還可以增加溶液的粘度，使得純化磁珠不易沉降。連接后的接頭產(chǎn)物需要經(jīng)過純化，避免對下一步的PCR擴(kuò)增造成影響

連接流程

接頭連接及PCR

連接體系

文獻(xiàn)1 連接體系

磁珠純化

• 磁珠法目前已廣泛的應(yīng)用核酸純化，磁珠的主要結(jié)構(gòu)有三層，分別是最內(nèi)側(cè)的聚苯乙烯內(nèi)核，中間層的Fe3O4，已經(jīng)最外層的官能團(tuán)修飾的高分子材料，而官能團(tuán)的不同則決定了磁珠的功能不同，如提取，生物素捕獲，片段篩選等。
• NGS使用最多的還是貝克曼AMPure XP Beads。XP磁珠采用SPRI技術(shù)（固相可逆固定化技術(shù)），在較高的PEG及鹽離子存在的條件下，核酸可以脫去水化層，DNA膠體的熱力學(xué)穩(wěn)定性及構(gòu)想被破壞，導(dǎo)致大量帶負(fù)電荷的磷酸集團(tuán)暴露出來，通過Na+與磁珠的羧基集團(tuán)形成電橋，進(jìn)而被吸附在磁珠表面。而磁珠則因?yàn)閮?nèi)核的順磁性，可以通過外加磁場進(jìn)行富集。
• 磁珠體系的主要成分是磁珠，聚乙二醇（PEG），NaCl以及一些輔助成分。
  PEG主要作用為脫去一些親水性生物大分子的水化層，以及增加buffer的粘性，避免磁珠沉降，在DNA連接反應(yīng)中也可以用于提高連接效率。PEG的分離效果受溫度及pH的影響，所以在磁珠使用之前需要平衡至室溫。另外不同分子量的PEG效果也有差別。
  高濃度的鹽離子則是為了中和核酸的負(fù)電荷，使得核酸更容易凝聚。
• 在磁珠體系中，還會加入一些潤滑劑，如Tween 20，可以有效地減少磁珠的殘留。

Pre-PCR

文獻(xiàn)1 PCR體系

文獻(xiàn)1 PCR引物

此步驟需要注意的是，如果使用的是PCR free接頭，則使用Universal P5/P7 Primer進(jìn)行預(yù)文庫擴(kuò)增；如果使用的是通用PCR amplification接頭，則需要使用相應(yīng)的indexing P5/P7 Primer進(jìn)行預(yù)文庫擴(kuò)增。一般根據(jù)投入量及接頭連接效率進(jìn)行估算PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，接頭連接效率一般在30%左右，磁珠純化回收率約在70%，默認(rèn)PCR擴(kuò)增效率為100%，計(jì)算能夠達(dá)到1500ng預(yù)文庫產(chǎn)量的循環(huán)數(shù)（通常1500ng預(yù)文庫足夠兩次捕獲的投入量，盡可能控制較少的循環(huán)數(shù)避免引入PCR偏差）

液相雜交捕獲

液相雜交分類

吸附雜交：磁珠吸附雜交，親和吸附雜交，羥基磷灰石雜交
發(fā)光液相雜交

溫度選擇

1. 雜交溫度
   雜交技術(shù)最重要的因素之一就是選擇合適的雜交溫度通常雜交反應(yīng)溫度低于Tm 10-15℃時(shí)，高度同源的堿基序列可以形成穩(wěn)定的雜交鏈。一般情況下，在不含甲酰胺的體系中，雜交反應(yīng)都是在65℃進(jìn)行，當(dāng)含有50%的甲酰胺時(shí)，在42℃進(jìn)行雜交。
2. Tm影響因素
   綜合來說影響Tm值的兩個(gè)核心因素就是“氫鍵”及“離子鍵”，只要是能夠影響這兩個(gè)因素的都可以影響到Tm，比如：

• DNA的大小及堿基組成
• buffer中的鹽離子可以與核酸的磷酸骨架形成離子鍵，增加Tm
• pH
• 變性劑

捕獲探針選擇

1. 分類
   目前NGS應(yīng)用較為廣泛的探針主要有：

• IDT探針：DNA探針，長度為120mer，探針設(shè)計(jì)為end to end tilling
• Roche探針：DNA探針，長度為60-90mer
• Agilent探針：RNA探針，長度為120mer
  通常RNA探針效果更優(yōu)，因?yàn)镈NA-RNA雜交鏈更穩(wěn)定。探針的長度在100bp左右時(shí)，捕獲效率更好。

雜交反應(yīng)時(shí)間選擇

雜交反應(yīng)時(shí)間太短，則雜交效率較低；雜交反應(yīng)時(shí)間太長，則會形成大量的非特異性結(jié)合產(chǎn)物。所以一般雜交反應(yīng)時(shí)間在16-20h，雜交反應(yīng)的溫度一般低于Tm 5-12℃（100bp左右的探針Tm約在80左右，參考3.2）

雜交嚴(yán)謹(jǐn)性

• 雜交體系中，避免非同源或者部分同源的核酸序列形成雜交復(fù)合物的嚴(yán)格程度
• 影響雜交體系的穩(wěn)定性因素決定了雜交反應(yīng)體系的嚴(yán)謹(jǐn)性，一般認(rèn)為低于雜交體系20度雜交效果最優(yōu)（這只是個(gè)經(jīng)驗(yàn)值，具體溫度需要試驗(yàn)驗(yàn)證）
• 可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算雜交體的Tm值，隨后通過調(diào)節(jié)鹽離子濃度，pH，甲酰胺濃度，以及雜交溫度等來控制雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性。

文庫雜交捕獲流程（參考文獻(xiàn)1，文獻(xiàn)2）

雜交buffer 組分

文獻(xiàn)1 雜交buffer成分

• 10×SSPE buffer：SSPE緩沖液(20×,pH7.4)主要由氯化鈉、磷酸鹽、EDTA等組成，主要用于RNA雜交(如Northern印跡)、DNA雜交(如Sorthern印跡)等核酸雜交
• 10×Denhardt’s solution：主要作為雜交封閉劑，用于封阻非特異性結(jié)合，50×Denghardt’s solution主要成分為1%聚蔗糖（Ficoll 400），1%聚乙烯吡咯烷酮（pvp），以及1%牛血清白蛋白（BSA）
• 10mM EDTA
• 0.2% SDS

封閉劑

文獻(xiàn)1 封閉組分

文獻(xiàn)1 block oligo

• Human cot1 DNA：主要用于封阻基因組中一些高度重復(fù)的序列
• Universal block oligo：主要用于封阻接頭序列（與接頭序列反向互補(bǔ)）
• 鮭魚精DNA：保護(hù)cot1 DNA及block oligo，防止其被降解。

探針

文獻(xiàn)1 探針組分

• Probe：RNA探針
• RNA酶抑制劑

洗脫液

• SSC（saline sodium citrate）緩沖溶液是分子生物學(xué)中最標(biāo)準(zhǔn)的印跡和雜交處理溶液，旨在用于各種雜交實(shí)驗(yàn)達(dá)到變性和清洗的目的，主要成分為氯化鈉和檸檬酸鈉。SSC緩沖液中檸檬酸鈉起緩沖作用，鹽離子（Na ）中和核酸主鏈上的負(fù)電荷，使其呈電中性，這樣可以使探針和靶序列的結(jié)合比較容易進(jìn)行。也用于SDS-PAGE電泳分離膠配制。用于核酸雜交，不同濃度作用不同：
  2×SSC：高鹽洗膜，洗去部分非特異性結(jié)合的探針。
  0.5×SSC：低鹽洗膜，增加核酸鏈的嚴(yán)緊性，使得 RNA/DNA 之間的排斥力增加。
• SDS是一種陰離子去垢劑，它的主要作用有：①溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；②解聚細(xì)胞中的核蛋白，使蛋白質(zhì)與DNA分開；③SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止對DNA的降解。
• 洗脫過程中，預(yù)雜交的目的是將硝酸纖維素膜上的非特異結(jié)合DNA位點(diǎn)使用與目的DNA同源性較差的分子(鮭魚精DNA或者牛血清等)進(jìn)行封閉,洗膜則是為了將未能特異性結(jié)合的DNA分子洗脫;預(yù)雜交、雜交兩者處理溫度相同,可以確保在目標(biāo)DNA的雜交溫度(約為Tm值-10℃)條件下,非特異性位點(diǎn)能夠充分封閉,從而提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性;洗膜溫度可以與雜交溫度相同,也可進(jìn)行梯度洗脫,總的來說,離子強(qiáng)度大,洗脫溫度高,則實(shí)驗(yàn)精確性越高.

• Beads wash buffer：1×TE + 1M NaCl（文獻(xiàn)1使用M-280鏈霉親合素磁珠

  
  
  文獻(xiàn)1 磁珠洗滌液

• Low stringency buffer：1×SSC + 0.1% SDS；室溫孵育15min

  
  
  文獻(xiàn)1 低嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫液

• High stringency buffer：0.1×SSC + 0.1% SDS；65℃，10min，重復(fù)洗滌共三次。

  
  
  文獻(xiàn)1 高嚴(yán)謹(jǐn)性洗脫液
• 0.1N NaOH變性，室溫孵育10min，去上清
• 1M Tris-Cl中和NaOH后即可進(jìn)行純化

illumina測序

簇生成過程

• 文庫結(jié)構(gòu)

  
  
  illumina文庫結(jié)構(gòu)

• 測序流程

  
  
  illumina測序流程

測序

• 單端index測序(all plateforms)

  
  
  單端index測序流程

• 雙端index測序（Hiseq 2500，Miseq，Novaseq）

  
  
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• 雙端index測序（Nextseq，Miniseq，Hiseq 3000/4000）
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測序儀

• 各種儀器介紹

  
  
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• Flowcell

  
  
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Reference

1. Blumenstiel B, Cibulskis K, Fisher S, et al. Targeted exon sequencing by in‐solution hybrid selection[J]. Current Protocols in Human Genetics, 2010, 66(1): 18.4. 1-18.4. 24.
2. Gnirke A, Melnikov A, Maguire J, et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(2): 182.