?????眾所周知，DNA序列就是有TCGA四種堿基按照一定的排列順序排列而成，但是如何才能將每一個(gè)位置上的堿基識(shí)別出來(lái)卻是一個(gè)很難解決的問(wèn)題，正是因?yàn)檫@要的需求，測(cè)序技術(shù)也在科學(xué)家們的不斷努力下開(kāi)始慢慢的發(fā)展了起來(lái)。今天我們就來(lái)介紹一下測(cè)序技術(shù)發(fā)展的前世今生。
第一代測(cè)序技術(shù)：
????第一代測(cè)序技術(shù)通常是指桑格（Sanger）和考爾森(Coulson)開(kāi)創(chuàng)的鏈終止法或者是馬克西姆（Maxam）和吉爾伯特（Gilbert）發(fā)明的化學(xué)法（鏈解法）。今天這里重點(diǎn)講一下桑格測(cè)序法，因?yàn)槠渌麥y(cè)序方法的核心也是利用了桑格測(cè)序中中斷DNA合成反應(yīng)的原理。
????桑格測(cè)序法的核心原理是利用ddNTP（雙脫氧核苷酸）代替dNTP（脫氧核苷酸），ddNTP由于3’位沒(méi)有羥基，就會(huì)導(dǎo)致沒(méi)有辦法結(jié)合下一個(gè)核苷酸，從而使反應(yīng)終止。這樣就可以得到不同長(zhǎng)短的序列片段，每個(gè)片段的末端都是一個(gè)ddNTP。
在此基礎(chǔ)之上，給每一個(gè)雙脫氧核苷酸加上熒光發(fā)光基團(tuán)，并且每一種堿基的發(fā)光基團(tuán)的顏色不同，然后通過(guò)顏色來(lái)識(shí)別不同的位置堿基序是哪一個(gè)。
這里需要說(shuō)明一下的就是在合成DNA的過(guò)程中除了加入ddNTP和其他一些必要的酶之外，還需要加入能使DNA進(jìn)行正常合成的dNTP，這樣才能使DNA正常合成不同長(zhǎng)短的DNA片段，然后再在這些片段的基礎(chǔ)上隨機(jī)結(jié)合ddNTP，最后通過(guò)測(cè)定ddNTP的熒光信號(hào)來(lái)測(cè)定某個(gè)位置是哪一個(gè)具體堿基。如果只加入ddNTP的話，反應(yīng)則永遠(yuǎn)終止在第一步，則只能測(cè)定第一個(gè)位置是哪一個(gè)具體的堿基。
更加詳細(xì)的內(nèi)容很難用文字來(lái)表述，推薦兩個(gè)視頻給大家：
桑格測(cè)序法基本原理：https://www.bilibili.com/video/av44735204?from=search&seid=15245763323065606962
陳巍學(xué)老師的第一代測(cè)序技術(shù)的原理：https://www.bilibili.com/video/av3174601?from=search&seid=9488703116600135042
第二代測(cè)序技術(shù)：
????二代測(cè)序技術(shù)有很多，但是很多現(xiàn)在都已經(jīng)不用了，這里我們就講解一下二代測(cè)序的巨頭——Illunima測(cè)序（占市場(chǎng)99%）。其原理是基于可逆終止的熒光標(biāo)記dNTP來(lái)做邊合成邊測(cè)序工作，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是將打斷的DNA片段利用橋式PCR擴(kuò)增之后再利用熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行辨別，這里需要注意的有幾個(gè)點(diǎn)：第一，在flowcell中的每個(gè)簇對(duì)應(yīng)一個(gè)片段，每個(gè)槽中都有很多個(gè)簇，之所以這樣做是為了后面在橋式PCR之后熒光信號(hào)被增強(qiáng)，方便測(cè)量，也提高準(zhǔn)確度。第二，由于堿基被進(jìn)行了特殊的修飾，所以每次合成只能添加一個(gè)堿基，每進(jìn)行一次合成就會(huì)放到測(cè)序的機(jī)器上進(jìn)行一次熒光信號(hào)檢測(cè)，記錄熒光信號(hào)，推出堿基。第三，測(cè)序完成之后，一輪測(cè)序完成后，會(huì)對(duì)已經(jīng)添加到序列上的堿基進(jìn)行處理，也就是讓它變回原來(lái)正常的樣子，用以進(jìn)行下一步的合成，然后重復(fù)合成測(cè)序修飾合成測(cè)序修飾。
相比于第一代測(cè)序技術(shù)，第二代測(cè)序技術(shù)的有點(diǎn)就是高通量，一次可以測(cè)很多序列，而且準(zhǔn)確性也不低，缺點(diǎn)就是測(cè)序的長(zhǎng)度一般在200-500bp。
同樣的給大家推薦兩個(gè)視頻，幫助大家理解：
Illunima測(cè)序原理：https://www.bilibili.com/video/av37902855/?spm_id_from=333.788.videocard.2
陳巍學(xué)老師的Illunima測(cè)序化學(xué)原理（不是原版，但是有字幕）：https://www.bilibili.com/video/av23072634/?spm_id_from=333.788.videocard.2
第三代測(cè)序技術(shù)：
????第三代測(cè)序技術(shù)是一種單分子測(cè)序技術(shù)，在測(cè)序過(guò)程中不需要進(jìn)行PCR，實(shí)現(xiàn)了對(duì)一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序，相比二代測(cè)序技術(shù)，由于只測(cè)定一個(gè)分子的，這樣就減少了二代測(cè)序不同片段合成不同步的噪音，同時(shí)還可以測(cè)定出堿基的甲基化以及突變的情況，三代測(cè)序的原理主要有兩種，一種是單分子熒光測(cè)序，一種是納米孔測(cè)序，這里主要講一下PacＢｉｏ測(cè)序技術(shù)原理：這種測(cè)序方法主要是在一個(gè)測(cè)序板上的測(cè)序小孔中固定一個(gè)聚合酶，然后當(dāng)這個(gè)聚合酶每結(jié)合一個(gè)帶熒光的堿基（熒光基團(tuán)結(jié)合在焦磷酸基團(tuán)上）時(shí)就會(huì)保持這種結(jié)合模式一段時(shí)間，小孔中有激發(fā)光不斷打入，這個(gè)堿基就會(huì)發(fā)出熒光，儀器根據(jù)顏色判斷是哪一種堿基，一段時(shí)間后，焦磷酸基團(tuán)會(huì)掉落，因此熒光基團(tuán)也會(huì)隨焦磷酸基團(tuán)掉落，不影響下一輪的測(cè)定，然后結(jié)合照射測(cè)定掉落結(jié)合照射測(cè)定掉落反復(fù)進(jìn)行，直至全部測(cè)定完成。
相比二代測(cè)序技術(shù)，三代測(cè)序技術(shù)所需的時(shí)間更短，測(cè)定的長(zhǎng)度最長(zhǎng)可到３萬(wàn)個(gè)堿基，同時(shí)還可以測(cè)出堿基基團(tuán)的甲基化和突變情況，越來(lái)越受到人們關(guān)注。 同樣的兩個(gè)視頻推薦給大家方便理解，我也是在看了很多視頻之后才懂了這一丁半點(diǎn)。由于沒(méi)有找到很好的ＰａｃＢｉｏ測(cè)序技術(shù)的視頻，所以這里只能給大家放一個(gè)陳巍學(xué)老師的對(duì)于該技術(shù)的原理的講解視頻：https://www.bilibili.com/video/av79281575?from=search&seid=10411536782770729419
????每一代測(cè)序技術(shù)都有很多種，但是由于個(gè)人能力和時(shí)間關(guān)系，沒(méi)有辦法把每一種都展示出來(lái)，如果大家有對(duì)哪一種測(cè)序方法感興趣，可以私信我，我本身就是生信專業(yè)，所以了解每一種測(cè)序方法是職責(zé)之內(nèi)的事也是對(duì)自己的一種鍛煉，我會(huì)盡量去了解透之后為大家展示出來(lái)，感謝指點(diǎn)。
? ? 如果文章有什么不對(duì)的地方請(qǐng)大家多多批評(píng)，下期文章我想主要講解拿到序列之后該怎么解讀，怎么分析，請(qǐng)大家多多關(guān)注。
