研究背景：

膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）作為成人最常見且侵襲性最強的原發(fā)性惡性腦腫瘤，其治療核心在于最大化安全切除范圍，但腫瘤細胞彌漫性浸潤使完全切除面臨兩難——過度切除導致神經(jīng)功能缺損，殘留病灶則增加復發(fā)風險。傳統(tǒng)影像技術（MRI、CT）及術中病理檢查因程序復雜、靈敏度有限等缺陷難以實現(xiàn)實時精準邊界界定；熒光導航手術雖可提供實時引導，但單酶激活型探針因脫靶激活產(chǎn)生假陽性信號，嚴重制約手術精度。近年發(fā)展的級聯(lián)激活型"雙鎖"探針通過生物標志物協(xié)同識別與邏輯門控機制，可更有效區(qū)分腫瘤與正常細胞，其中GBM中高度共表達的組織蛋白酶B（Cat B）與單胺氧化酶（MAO）為級聯(lián)激活提供了理想靶點組合，聯(lián)合靶向肽Angiopep-2（ANG）介導的血腦屏障穿透，為診斷探針的腦內(nèi)遞送和腫瘤特異性激活提供了有效解決方案。

針對上述問題，北京工業(yè)大學蘇東東團隊聯(lián)合湖南大學袁林團隊及揚州大學、河北大學附屬醫(yī)院神經(jīng)外科合作，設計開發(fā)了ANG-hCy-MC級聯(lián)識別可激活探針。該探針整合：（1）Angiopep-2（ANG）基序介導LRP1轉(zhuǎn)胞吞跨越BBB并進入GBM細胞；（2）串聯(lián)酶響應底物實現(xiàn)Cat B與MAO順序激活，形成級聯(lián)"雙鎖"機制確保腫瘤限制性熒光激活；（3）近紅外（NIR）熒光團實現(xiàn)深組織成像。該探針通過順序兩步酶級聯(lián)（Cat B初始切割后MAO觸發(fā)脫烷基化）將熒光開啟嚴格限制于共表達兩種酶的腫瘤微環(huán)境，顯著降低脫靶信號，實現(xiàn)GBM邊緣的精確界定。該文章于2026年2月10日以《A Cascade Recognition of Activatable Probe for Fluorescence Navigation Glioblastoma Surgery:Overcoming Blood-Brain Barrier and Off-Target Limitations》為題發(fā)表于《Advanced Science》（DOI：10.1002/advs.202521404）。

方案1 ANG-hCy-MC級聯(lián)激活設計策略及GBM檢測生物醫(yī)學應用。（A）ANG-hCy-MC的化學結構及級聯(lián)激活機制。（B）1）穿透血腦屏障及激活過程示意圖。2）熒光導航手術切除。（C）人GBM組織切片中侵襲性邊緣的界定。

（1）ANG-hCy-MC的理性設計與合成

探針以半花菁熒光團（hCy-OH）為骨架，通過親核取代反應連接MAO響應底物（叔丁基N-(3-溴丙基)氨基甲酸酯），經(jīng)脫保護得到中間體hCy-M；隨后通過酰胺縮合引入Cat B可切割底物（Boc-Val-Cit-OH），最終脫保護獲得核心熒光單元hCy-MC。ANG肽通過銅催化疊氮-炔環(huán)加成反應（CuAAC）偶聯(lián)，得到終產(chǎn)物ANG-hCy-MC。為系統(tǒng)評估靶向特異性與級聯(lián)激活行為，同步合成了單酶響應對照探針ANG-hCy-M（僅MAO激活）及非靶向?qū)φ仗结楶EG-hCy-MC（無LRP1親和力）。紫外-可見吸收光譜顯示ANG-hCy-MC在~250 nm處吸收顯著增強，證實ANG肽成功偶聯(lián)；Zeta電位分析進一步驗證了靶向肽的連接。關鍵化合物經(jīng)高分辨質(zhì)譜（HRMS）及核磁共振（1H NMR、13C NMR）確證結構。

（2）ANG-hCy-MC級聯(lián)酶激活的光譜學驗證

為驗證探針的雙酶級聯(lián)響應機制，系統(tǒng)考察了不同酶條件下的光化學性質(zhì)。僅在Cat B與MAO同時存在時，ANG-hCy-MC才表現(xiàn)出吸收強度顯著增加（~650 nm）及708 nm處強熒光開啟，確認順序雙酶級聯(lián)對熒光激活的必要性。單酶處理幾乎無信號變化，凸顯協(xié)同酶切的關鍵作用。熒光強度與雙酶濃度呈線性關系（y=256.8x+11300.5, R2=0.997），具備酶活性定量檢測潛力。探針對目標酶顯示出高度特異性，生物相關干擾物質(zhì)均無法觸發(fā)顯著熒光信號。此外，ANG-hCy-MC及其激活產(chǎn)物在連續(xù)激發(fā)下熒光信號穩(wěn)定，光穩(wěn)定性優(yōu)異（圖1）。

圖1. ANG-hCy-MC的體外表征。(A) 串聯(lián)酶激活機制示意圖；(B) ANG-hCy-MC（10 μM）在四種條件下的紫外-可見吸收光譜：單獨探針、+MAO、+Cat B、+Cat B+MAO，于PBS（10×, pH 7.4）及EDTA（1 mM）中37°C孵育10 h；(C) 對應條件下的熒光發(fā)射光譜（λex/em=680/708 nm）；(D) 不同濃度Cat B（0-60 U/L）與MAO（0-60 mg/L）存在下ANG-hCy-MC的濃度依賴性熒光響應；(E) 低酶濃度范圍內(nèi)的線性校準曲線：Cat B（0-26 U/L）與MAO（0-26 mg/L）；(F) 選擇性評估：ANG-hCy-MC與生物相關分析物孵育后的708 nm處熒光強度。

（3）hCy-MC雙酶級聯(lián)激活機制的驗證

通過光譜、HPLC及HRMS全面闡明了hCy-MC的順序激活過程。僅在Cat B與MAO共孵育時，hCy-MC才出現(xiàn)680 nm處熒光顯著放大。HPLC分析顯示：Cat B單獨處理生成中間體hCy-M（保留時間7.8 min, m/z=493.2847 [M]?）；MAO單獨處理不改變hCy-MC保留時間，證實Cat B可切割片段作為"門衛(wèi)"防止MAO過早激活；雙酶順序處理產(chǎn)生新色譜峰對應終產(chǎn)物hCy-OH（保留時間9.7 min, m/z=436.2268 [M]?）。HRMS進一步確認了各步轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的精確分子量。多維度證據(jù)確立了級聯(lián)激活機制：Cat B水解酰胺鍵后，MAO介導氧化脫胺釋放熒光團hCy-OH，該門控策略最小化脫靶激活，為高保真分子成像奠定基礎（圖2）。

圖2. hCy-MC級聯(lián)激活機制的體外驗證。(A) hCy-MC針對Cat B與MAO順序激活的示意圖；(B) hCy-MC（10 μM）在四種條件下的紫外-可見吸收光譜：單獨hCy-MC、+MAO、+Cat B、+MAO+Cat B；(C) 對應條件下的熒光發(fā)射光譜（λex/em=660/680 nm）；(D) 驗證hCy-MC響應機制的色譜圖；(E) HRMS驗證：hCy-MC（精確質(zhì)量749.4385）、hCy-MC+Cat B生成hCy-M（m/z=493.2847）、hCy-MC+MAO+Cat B生成hCy-OH（m/z=436.2268）。

（4）ANG-hCy-MC對GBM細胞的高特異性成像

GL261及U87膠質(zhì)瘤細胞系（確認表達Cat B與MAO）用于評估靶向攝取與級聯(lián)激活。CCK-8實驗顯示ANG-hCy-MC在測試濃度范圍內(nèi)細胞存活率>90%，生物相容性良好；共聚焦成像顯示其經(jīng)LRP1介導內(nèi)化并在胞內(nèi)激活熒光。CA-074（Cat B抑制劑）或氯吉靈（CL，MAO抑制劑）預處理均使熒光信號顯著降低（p<0.001），雙酶共激活的必要性及熒光強度與酶活性的線性相關性得以驗證。以低Cat B/MAO活性的CTX TNA2星形膠質(zhì)細胞為正常對照，ANG-hCy-MC的GL261/CTX TNA2熒光強度比顯著高于單鎖探針ANG-hCy-M（p<0.001），雙酶級聯(lián)策略通過要求Cat B與MAO共表達有效抑制脫靶激活；U87細胞中觀察到一致趨勢，證實該探針在不同GBM亞型中的特異性識別穩(wěn)健性（圖3）。

圖3. ANG-hCy-MC在GL261 GBM細胞中的細胞熒光成像及體外BBB穿透評估。(A) 探針在GBM細胞中的激活示意圖；(B) 酶抑制條件下GL261細胞與ANG-hCy-MC（10 μM）孵育的共聚焦成像：(a)未處理對照；(b)Cat B抑制劑CA-074（100 μM, 2 h）預處理；(c)MAO抑制劑氯吉靈（CL, 100 μM, 2 h）預處理；(d)CA-074+CL聯(lián)合處理；(C) GL261（膠質(zhì)瘤）與CTX TNA2（正常）星形膠質(zhì)細胞的對比成像；(D) (B)中熒光強度的定量分析；(E) (C)中GL261與CTX TNA2細胞的熒光強度比值（F_GL261/F_CTX TNA2）；(F) 基于Transwell的體外BBB模型示意圖；(G) 下室GL261細胞的代表性CLSM圖像：(i)空白對照；(ii)PEG-hCy-MC處理組；(iii)ANG-hCy-MC處理組；(H) (G)中GL261細胞熒光強度的定量分析。

（5）體外BBB模型驗證ANG-hCy-MC的穿透能力

采用Transwell體外BBB模型評估ANG介導的主動BBB穿越能力。在上室接種bEnd.3細胞形成模擬BBB的單層，下室接種GL261細胞。ZO-1免疫熒光染色證實內(nèi)皮屏障的完整性與功能性。非靶向探針PEG-hCy-MC保留雙酶級聯(lián)激活特性，作為適當對照。孵育48 h后，ANG-hCy-MC有效穿越bEnd.3內(nèi)皮屏障，在下室GL261細胞內(nèi)內(nèi)化并激活紅色熒光；而PEG-hCy-MC屏障穿透有限，靶細胞熒光信號微弱。定量分析顯示ANG-hCy-MC組熒光強度較PEG-hCy-MC組高3倍以上，證明ANG偶聯(lián)顯著增強BBB通透性，為體內(nèi)應用奠定實驗基礎（圖3F-H）。

（6）原位GBM小鼠模型中ANG-hCy-MC的體內(nèi)靶向熒光富集驗證

皮下移植瘤模型中，瘤內(nèi)預注射Cat B抑制劑CA-074或MAO抑制劑CL均較PBS對照組顯著降低熒光信號，驗證酶依賴性激活機制；未處理組腫瘤部位特異性激活，并經(jīng)肝腎清除。原位GL261-Luc模型進一步評估腦靶向與激活特異性：靜脈注射后1 h，ANG-hCy-MC組GBM區(qū)域即出現(xiàn)強熒光，3 h達峰，12 h仍維持顯著信號，非腫瘤腦區(qū)背景極低；PEG-hCy-MC組腫瘤熒光微弱，3 h時強度較ANG-hCy-MC組低6倍。離體成像顯示ANG-hCy-MC的腫瘤/正常腦組織熒光比（T/N）為4倍，顯著高于PEG-hCy-MC的1.7倍。主要臟器H&E染色未見異常，生物安全性良好（圖4）。

圖4. 原位GL261 GBM小鼠模型中ANG-hCy-MC的體內(nèi)靶向熒光富集驗證。(A) 腫瘤種植與成像時間線的實驗示意圖；(B) 荷瘤小鼠的體內(nèi)熒光成像：(a)ANG-hCy-MC組；(b)PEG-hCy-MC組；(C) (B)中體內(nèi)腫瘤熒光強度的定量分析（***p<0.001）；(D) 給藥12 h后離體器官的熒光圖像：(a)ANG-hCy-MC組；(b)PEG-hCy-MC組；(E) (D)中離體器官熒光強度的定量分析；(F) 顯示腫瘤-正常對比的代表性腦圖像：(i)ANG-hCy-MC組；(ii)PEG-hCy-MC組（紅色虛線：腫瘤區(qū)域）；(G) (F)中腫瘤-正常腦組織熒光比的定量分析。

（7）GBM的熒光導航手術切除與細胞級邊界界定

ANG-hCy-MC的腫瘤靶向能力與成像對比度在熒光導航手術切除中得以驗證：探針注射12 h后，NIR熒光引導下腫瘤切除，生物發(fā)光與熒光信號共定位確認靶向精確性；切除后部位熒光信號大幅減弱，后續(xù)生物發(fā)光成像驗證腫瘤完全切除。離體組織切片評估顯示，原位小鼠GBM模型冰凍切片（5 μm）中H&E染色確認腫瘤邊界，ANG-hCy-MC熒光在病理邊界處急劇下降，低倍下即可清晰判別；與單鎖探針ANG-hCy-M相比，ANG-hCy-MC熒光與腫瘤邊緣緊密對齊，鄰近正常組織信號極小，F(xiàn)_T/F_N比值較ANG-hCy-M高約1.5倍，最大T/N比達11.61倍，10倍放大下仍維持10.45倍（圖5）。

圖5. 原位GBM模型中的熒光導航腫瘤切除及細胞級邊緣界定。(A) 熒光導航腫瘤切除及原位模型邊緣評估流程示意圖；(B) 腫瘤切除前后的術中生物發(fā)光與熒光圖像（紅色虛線區(qū)域：GBM及切除區(qū)域）；(C) 確認腫瘤完全切除的離體腦圖像（λex/em=680/710 nm）；(D) 小鼠GBM邊緣分析：H&E染色及對應ANG-hCy-MC熒光（10 μM, 30 min）的(a,c)低倍與(b,d)高倍圖像，比例尺：(a,c) 1 mm；(b,d) 100 μm，虛線指示腫瘤邊緣；(E) (D(a,b))中腫瘤與鄰近正常區(qū)域熒光強度的定量分析；(F) (D(c,d))中腫瘤與鄰近正常區(qū)域熒光強度的定量分析。

（8）人GBM標本中侵襲邊緣的細胞級精準界定

ANG-hCy-MC在臨床人GBM組織切片中的細胞級邊界界定性能得到驗證：H&E染色顯示腫瘤呈侵襲性生長、邊界不清，熒光共聚焦顯微鏡顯示ANG-hCy-MC強烈標記腫瘤區(qū)域并與組織病理學特征高度一致，腫瘤邊緣熒光強度較正常實質(zhì)顯著升高（***p<0.001），3D Z-stack重建確認熒光局限于惡性區(qū)域，穿透深度約40 μm。浸潤區(qū)共定位評估顯示，ANG-hCy-MC準確勾勒侵襲邊緣及分散腫瘤細胞，熒光強度在過渡至正常組織時急劇下降，10倍放大下T/N比仍達7.83倍，熒光界定邊界與H&E染色病理邊界高度一致，單細胞分辨率下侵襲前沿精確識別得以實現(xiàn)（圖6）。

圖6. 利用ANG-hCy-MC精準界定人GBM標本中的侵襲邊緣。(A) 臨床GBM標本處理流程；(B) 人GBM邊緣驗證：H&E染色界定的組織結構與ANG-hCy-MC熒光的共定位（比例尺：100 μm）；(C) (B)中腫瘤灶與正常實質(zhì)的熒光強度對比；(D) ANG-hCy-MC（10 μM）Z軸掃描確認GBM標本中的3D限制性激活；(E) 臨床GBM冰凍切片的邊緣分析：H&E染色及對應ANG-hCy-MC熒光（10 μM, 30 min）的(i,ii)低倍與(iii,iv)高倍圖像，比例尺：(i,ii) 1 mm；(iii,iv) 100 μm，虛線指示GBM邊緣區(qū)域；(F) (E(i,ii))中腫瘤與鄰近正常區(qū)域熒光強度的定量分析；(G) (E(iii,iv))中腫瘤與鄰近正常區(qū)域熒光強度的定量分析。

「?研究小結?」

本研究開發(fā)了ANG-hCy-MC可激活探針，通過ANG功能化修飾實現(xiàn)LRP1受體介導的血腦屏障穿透和腫瘤富集，結合Cat B/MAO串聯(lián)酶級聯(lián)激活機制降低背景信號。該探針在原位小鼠模型和人GBM標本中均實現(xiàn)高腫瘤/正常組織對比度（最高達11.61倍）及侵襲邊緣單細胞分辨率，可精確實時勾勒腫瘤邊界，在熒光手術導航中展現(xiàn)出顯著的臨床轉(zhuǎn)化潛力，為提高GBM切除完整性和改善患者預后提供了新策略。