重測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

全基因組重測(cè)序(Resequencing)是對(duì)已知參考基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體間的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。通過(guò)全基因組重測(cè)序，將不同梯度插入片段（Insert-Size）的測(cè)序文庫(kù)結(jié)合短序列（Short-Reads）、雙末端（Paired-End），可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)、拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation，CNV)、插入缺失(InDel，Insertion/Deletion)、結(jié)構(gòu)變異(Structure Variation，SV) 等變異信息，應(yīng)用范圍涉及臨床醫(yī)藥研究、群體遺傳學(xué)研究、關(guān)聯(lián)分析、進(jìn)化分析等眾多領(lǐng)域。

原理

將特定組織或者細(xì)胞中的DNA進(jìn)行隨機(jī)打碎，構(gòu)建片段為350bp或者500bp的文庫(kù)，通過(guò)Illumina Hiseq對(duì)文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，從而獲得某一個(gè)個(gè)體所有DNA序列的信息。

全基因組數(shù)據(jù)分析的必要條件

1. 所測(cè)物種的序列是有參考基因組的
2. 所測(cè)序個(gè)體與參考基因組之間遺傳差異性不大 (read 比對(duì)不上，很難找到SNP 等突變信息）

評(píng)價(jià)測(cè)序量的指標(biāo)

測(cè)序深度是評(píng)價(jià)測(cè)序量的最重要指標(biāo)。測(cè)序深度（Sequencing Depth）：測(cè)序得到的堿基總量（bp）與基因組大?。℅enome）的比值。
測(cè)序覆蓋比例（Sequencing Coverage），指的是基因組上至少被檢測(cè)到1次的區(qū)域，占整個(gè)基因組的比例。

例如，在某1個(gè)樣本測(cè)序的項(xiàng)目中，基因組平均測(cè)序深度為60X?；蚪M大部分區(qū)域的測(cè)序深度在60X左右，但同時(shí)依然有一小部分區(qū)域的測(cè)序深度低于3X（極低覆蓋或沒(méi)有覆蓋）。
當(dāng)然，這是理想條件下。在實(shí)際情況下的覆蓋度，會(huì)低于理想值。主要是由于GC含量偏好，基因組完整性，個(gè)體差異，重復(fù)序列影響等。

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如下圖，在某1個(gè)樣本測(cè)序的項(xiàng)目中，基因組平均測(cè)序深度為60X?；蚪M大部分區(qū)域的測(cè)序深度在60X左右，但同時(shí)依然有一小部分區(qū)域的測(cè)序深度低于3X（極低覆蓋或沒(méi)有覆蓋）。
當(dāng)然，這是理想條件下。在實(shí)際情況下的覆蓋度，會(huì)低于理想值。主要是由于GC含量偏好，基因組完整性，個(gè)體差異，重復(fù)序列影響等。

測(cè)序深度與基因組覆蓋度之間是一個(gè)正相關(guān)的關(guān)系，測(cè)序帶來(lái)的錯(cuò)誤率或假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)隨著測(cè)序深度的提升而下降。重測(cè)序的個(gè)體，如果采用的是Paired-End，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到10x時(shí)基因組的覆蓋度已接近飽和，基因組覆蓋度和測(cè)序錯(cuò)誤率控制均得以保證。

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但SNP的檢測(cè)率卻沒(méi)有達(dá)到飽和。這是由于當(dāng)深度達(dá)到10X的時(shí)候，雖然基因組大部分區(qū)域已被覆蓋，但在覆蓋到的區(qū)域中，依然有相當(dāng)多的區(qū)域深度小于3_{4X。SNP檢測(cè)的最低深度標(biāo)準(zhǔn)通常為3}4X。如果沒(méi)有達(dá)到這個(gè)水準(zhǔn)，則判斷其不可靠，而在分析結(jié)果中不予接受。為了進(jìn)一步減少低測(cè)序深度區(qū)域的比例，則需要進(jìn)一步提高測(cè)序深度。只有測(cè)序深度達(dá)到30X的時(shí)候，SNP檢測(cè)才會(huì)達(dá)到飽和

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因此，可以根據(jù)我們的研究目的來(lái)選擇相應(yīng)的測(cè)序深度。

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重測(cè)序應(yīng)用

目前重測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域，包括性狀相關(guān)候選基因篩選、動(dòng)植物育種、單基因病篩查、癌癥篩查等，快速準(zhǔn)確，對(duì)育種和臨床診斷有很好的指導(dǎo)作用。下面舉例一些重測(cè)序常用的應(yīng)用范圍和主要思路。

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1. 個(gè)體重測(cè)序，突變體檢查 （對(duì)每個(gè)個(gè)體的位點(diǎn)進(jìn)行掃描）
2. 混池重測(cè)序，群體進(jìn)化分析 （通過(guò)SNP進(jìn)行后續(xù)分析)
3. BSA，遺傳圖譜構(gòu)建
4. Hic-主要是做人類比較有用，這里不多說(shuō)了。

動(dòng)植物重測(cè)序文章思路

• GWAS與群體進(jìn)化相結(jié)合

隨著GWAS統(tǒng)計(jì)方法的不斷完善，GWAS能夠適用于大部分物種，將GWAS與群體進(jìn)化結(jié)合分析為性狀關(guān)鍵基因定位提供了一個(gè)新的思路。

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• GWAS與QTL定位相結(jié)合

連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析在數(shù)量性狀研究上都具有重要作用，它們?cè)赒TL定位的精度和廣度、提供的信息量、統(tǒng)計(jì)分析方法等方面具有明顯的互補(bǔ)性。

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簡(jiǎn)化基因組測(cè)序

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)是對(duì)與限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)相關(guān)的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序。

其實(shí)那么多種簡(jiǎn)化基因組方法的區(qū)別就在于單酶切還是雙酶切、是否有隨機(jī)打斷、使用不同的內(nèi)切酶、是否加barcode、接頭設(shè)計(jì)等這些細(xì)節(jié)，本質(zhì)還是一樣的，就是對(duì)基因組進(jìn)行酶切并對(duì)酶切片段進(jìn)行測(cè)序。在這些方法中，RAD和GBS是使用最廣泛的兩種方法，2b-RAD，dd-RAD，SLAF等都是在這些方法的基礎(chǔ)上在不同細(xì)節(jié)處改良。

RAD（Restriction site Associated DNA）：是與限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)相關(guān)的DNA。RAD方法對(duì)基因組DNA進(jìn)行單酶切，然后對(duì)酶切片段超聲波隨機(jī)打斷，因此測(cè)序得到的read1是位置對(duì)齊的，而read2是參差不齊的，因此可用于denovo聚類拼接，獲得較長(zhǎng)的contig，有利于開發(fā)SSR等分子標(biāo)記。

GBS（Genotyping-By-Sequencing）：是指通過(guò)測(cè)序進(jìn)行基因分型。2011年由Elshire, R. J.提出2。GBS方法對(duì)基因組DNA進(jìn)行單酶切，不需要超聲波隨機(jī)打斷，而是利用PCR進(jìn)行片段大小選擇；并且對(duì)不同的樣品加上不同的barcode，可對(duì)多達(dá)96個(gè)樣品進(jìn)行pooling建庫(kù)，簡(jiǎn)化了建庫(kù)步驟，因此比RAD成本更低?，F(xiàn)在的GBS經(jīng)過(guò)改良，普遍使用雙酶切了，雙酶切能夠得到在基因組上分布更均一的酶切片段。雙酶切的GBS，有時(shí)候又被稱為dd-RAD。

dd-RAD（double-digest RAD，也可以稱為dd-GBS）：是雙酶切的RAD，并且通過(guò)切膠來(lái)進(jìn)行片段選擇，2012年由Brant K.提出3。其實(shí)dd-RAD已經(jīng)放棄了經(jīng)典RAD的超聲波片段化的策略，dd-RAD的建庫(kù)流程和經(jīng)典的GBS更為相似，所以下文我們也將之稱為dd-GBS。 dd-RAD最大的優(yōu)勢(shì)在于，由于使用了兩種內(nèi)切酶處理，最終獲得片段在基因組上的分布更加均一，從而提高了數(shù)據(jù)的有效性。由于目前的GBS方法普遍使用雙酶切，并且用電泳切膠來(lái)取代PCR擴(kuò)增來(lái)選擇片段大小，因此dd-RAD幾乎等同于目前的GBS方法了

不同方法之間的比較：

簡(jiǎn)化基因組的應(yīng)用

簡(jiǎn)化基因組技術(shù)由于降低了基因組的復(fù)雜度、比全基因組重測(cè)序成本低，因此廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建與QTL定位、群體進(jìn)化分析、群體遺傳分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析等研究領(lǐng)域。那么，這么多種方法，應(yīng)該如何選擇呢？概括來(lái)說(shuō)可以從以下幾方面考慮：

1. 所需標(biāo)記數(shù)

不同的研究目的，所需的標(biāo)記數(shù)量并不完全一樣。通常，需要在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行功能區(qū)間掃描和功能基因挖掘的研究，如全基因組關(guān)聯(lián)分析和選擇壓力分析，就需要上萬(wàn)個(gè)高密度的分子標(biāo)記，而系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、地理群體結(jié)構(gòu)、基因流、系譜檢測(cè)、連鎖分析等研究的分子標(biāo)記密度則不需要那么高，一般只需要幾百到幾千個(gè)分子標(biāo)記足以完成分析。

對(duì)于基因定位的研究，不同的研究材料、作圖群體，也會(huì)影響到需要的標(biāo)記數(shù)目。例如利用自然群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，所需的標(biāo)記數(shù)與物種的LD衰減距離相關(guān)，物種LD衰減得越快，所需的標(biāo)記數(shù)就越多。又例如利用作圖群體進(jìn)行連鎖作圖QTL定位，所需的標(biāo)記數(shù)與作圖群體類型和群體大小有關(guān)。群體經(jīng)歷的世代越多（如RIL群體），群體越大，則重組事件越多，理論上提高標(biāo)記密度可以有效提高遺傳圖譜的質(zhì)量，所以所需的標(biāo)記數(shù)越多。

因此，可先評(píng)估研究所需的標(biāo)記數(shù)，再選擇適合的簡(jiǎn)化基因組技術(shù)。RAD技術(shù)因?yàn)閷?duì)所有酶切位點(diǎn)都檢測(cè)，因此標(biāo)記數(shù)要比GBS多，適合于需要標(biāo)記密度高的研究，如選擇壓力分析。dd-GBS類的技術(shù)雖然收集的片段偏少，但標(biāo)記分布更加均一，所以數(shù)據(jù)有效性更高；并且建庫(kù)成本比RAD低，更適合大樣品量的研究。

2.有無(wú)參考基因組

如果所研究物種沒(méi)有參考基因組，那么RAD技術(shù)更合適，因?yàn)镽AD技術(shù)可以利用不對(duì)齊的read2進(jìn)行denovo拼接，再與read1拼接，可以得到長(zhǎng)達(dá)400~500bp的片段，有利于SSR分子標(biāo)記開發(fā)以及后續(xù)的引物設(shè)計(jì)。而2b-RAD由于片段過(guò)短，容易受重復(fù)序列干擾，且后期不利于設(shè)計(jì)引物驗(yàn)證測(cè)序得到的SNP。因此，2b-RAD不建議用在沒(méi)有參考基因組的物種，和大的復(fù)雜的基因組上。

3.研究經(jīng)費(fèi)

簡(jiǎn)化基因組測(cè)序與全基因組重測(cè)序相比，由于只對(duì)酶切片段進(jìn)行測(cè)序，因此在測(cè)序費(fèi)用上大大下降。而由于目前的各種簡(jiǎn)化基因組技術(shù)都會(huì)使用barcode對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行混合建庫(kù)，因此各方法間的建庫(kù)成本差異已經(jīng)不大。但RAD文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中有超聲波打斷步驟、dd-RAD需要使用Pippin Prep等儀器，因此成本還是要比GBS等高。在實(shí)際情況中，可根據(jù)具體樣品數(shù)和研究經(jīng)費(fèi)選擇合適的技術(shù)方法。

總的來(lái)說(shuō)，RAD和GBS技術(shù)是使用最廣泛的兩種簡(jiǎn)化基因組技術(shù)，其他的技術(shù)方法都是在這兩者的基礎(chǔ)上的改進(jìn)或細(xì)化。

基因分型芯片

基因分型芯片：利用已知的SNP位點(diǎn)側(cè)翼的序列設(shè)計(jì)探針。探針固定在芯片上后，待測(cè)定樣本的DNA與芯片雜交并掃描雜交熒光信號(hào)，從而鑒定這些探針位點(diǎn)（SNP位點(diǎn)）的基因型。最有代表性的品牌是illumina和affymetrix。

與簡(jiǎn)化組測(cè)序技術(shù)相比較

從以上比較，我們可以認(rèn)為兩種技術(shù)都是高性價(jià)比的大規(guī)模基因分型的方法。但最大的不同的是：

1. 芯片基因分型本質(zhì)上是對(duì)已知SNP多態(tài)位點(diǎn)的掃描，來(lái)確定樣本在這個(gè)位點(diǎn)的基因型。（其實(shí)很多做人類醫(yī)療測(cè)序的都用的是芯片，人類的SNPs多態(tài)性信息已經(jīng)比較完善了）那么，我們需要預(yù)先知道這個(gè)物種的基因組SNPs多態(tài)性信息（一般來(lái)源大規(guī)模重測(cè)序），然后篩選SNP設(shè)計(jì)芯片，才能進(jìn)行后續(xù)的基因分型。打個(gè)比方：就是已經(jīng)知道這個(gè)位置有個(gè)“坑”了，只是看看坑里到底是沙子還是水。所以芯片只能“分型”，不能“發(fā)現(xiàn)”。
2. 簡(jiǎn)化基因組測(cè)序本質(zhì)上還是測(cè)序，所以哪怕這個(gè)物種沒(méi)有任何已知的SNPs信息，也能使用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)序兼顧了“發(fā)現(xiàn)”和“分型”的功能。

兩個(gè)技術(shù)的適用范圍

1. 沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化芯片的非模式物種

遇到非主流的無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化芯片的物種，測(cè)序無(wú)疑是最佳選擇。兼顧了SNP的發(fā)現(xiàn)和基因型分型兩個(gè)功能。

2. 有標(biāo)準(zhǔn)化芯片的模式物種

如果你研究的物種是人、豬、牛等這些物種，那么芯片公司的提供的芯片還是不錯(cuò)的選擇的。畢竟這些芯片位點(diǎn)都是優(yōu)化過(guò)的，基本是比較均勻地覆蓋了相應(yīng)物種的整個(gè)基因組。芯片的數(shù)據(jù)相對(duì)簡(jiǎn)單，后期數(shù)據(jù)的基本處理更簡(jiǎn)單。而測(cè)序數(shù)據(jù)，由于數(shù)據(jù)量大，后期數(shù)據(jù)的預(yù)處理復(fù)雜且需要較多計(jì)算資源。

那么，模式生物中是否抱定標(biāo)準(zhǔn)化芯片呢？也未必。主要還是兩點(diǎn)：

1）芯片密度是否滿足你的需求？

一些成熟的模式種，例如人，芯片密度都已經(jīng)達(dá)到了兆級(jí)別。但對(duì)于某些農(nóng)業(yè)種，芯片密度則還停留在較低的水平。例如：illumina玉米和綿羊的芯片，都停留在50k的密度水平，很久沒(méi)有優(yōu)化了。不過(guò)也可以理解他們的邏輯，反正芯片和測(cè)序儀都是他們家生產(chǎn)的。芯片密度不夠？測(cè)序啊。哪怕是使用只對(duì)基因組一部分進(jìn)行測(cè)序的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，也可以輕松獲得幾百k數(shù)量級(jí)的SNP標(biāo)記。所以，對(duì)于芯片密度不夠的情況下，測(cè)序是芯片很好的替代品。

2）對(duì)一些稀有位點(diǎn)的檢測(cè)

由于設(shè)計(jì)芯片只使用群體中具有普遍性的多態(tài)位點(diǎn)，即這些位點(diǎn)都是在群體中高頻出現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)。所以，對(duì)一般人群/種群進(jìn)行普遍性的篩查的時(shí)候，沒(méi)有太大的問(wèn)題。但如果，我們研究的群體十分特殊（如，研究材料是比較偏的亞種），或研究目標(biāo)就是低頻甚至罕見位點(diǎn)的時(shí)候（癌癥、家族遺傳病），芯片就無(wú)能為力了——因?yàn)樾酒暇蜎](méi)有這些位點(diǎn)的探針啊。

例如，你研究的是藏豬，那么豬的porcine 60k芯片效果就不會(huì)太好。因?yàn)樾酒系?0k位點(diǎn)都是從常見的品種中篩查得到的，這些位點(diǎn)在藏豬這樣的特殊亞種中可能多態(tài)性較差。而藏豬群體中普遍的多態(tài)性位點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)化芯片上卻沒(méi)有。那么，這個(gè)時(shí)候簡(jiǎn)化基因組測(cè)序的效果會(huì)優(yōu)于芯片。測(cè)序嘛，我測(cè)的是序列，管你SNPs稀有不稀有通通一網(wǎng)打盡。

總之，基因分型芯片和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序，各有優(yōu)缺點(diǎn)。在具體項(xiàng)目中，應(yīng)該根據(jù)具體情況做選擇。隨著測(cè)序價(jià)格不斷降低，測(cè)序的確會(huì)不斷侵蝕芯片的市場(chǎng)空間。但芯片依然有其穩(wěn)定、易標(biāo)準(zhǔn)化、效率高、成本容易控制等優(yōu)點(diǎn)，在某些需要標(biāo)準(zhǔn)化的領(lǐng)域（例如：醫(yī)療診斷領(lǐng)域）有巨大的應(yīng)用空間。