1 反應(yīng)體系：
2*Phanta max master mix：25ul
R：2ul（10uM）
F：2ul（10uM）
cDNA：21ul（稀釋過的）
2 反應(yīng)條件：
95℃ 3min
95℃ 15s
60℃ 15s
72℃ 1000bp/min
(2-4步30個循壞，不能多。）
72℃ 10min
4℃ (持續(xù)）
3 瓊脂糖1%+1%EB
樣品中加10x lodding buffer
樣品在負極，120V 40min 電泳
紫外燈，切膠 回收DNA。
4膠回收后
按照‘gel kit’試劑盒提取純化DNA，40ul dd水 60℃預熱溶解DNA。
5 酶切
DNA（提取純化的）：40ul；
5 μL 10x cut smart buffer
1 μL Cla1
1 μL kpn1
ddH2O補至50 μL
5 μg pLKO.1
5 μL 10x cut smart buffer
1 μL Cla1
1 μL Kpn1
ddH2O補至50 μL
37度酶切過夜
6 通過瓊脂糖電泳獲得線性化質(zhì)粒，同時進行純化回收。
DNA需要使用純化試劑盒直接純化，質(zhì)粒需要電泳跑膠純化（膠中的質(zhì)粒必須在曝光儀器上觀看，紫外容易導致突變）
質(zhì)粒酶切的時候會出現(xiàn)單鏈斷裂等情況，所以我們需要跑膠，進行膠回收，純化。質(zhì)粒需要用50ul水溶解，DNA片段需要使用20ul的水溶解。
7連接
將退火產(chǎn)物與線性化質(zhì)粒進行T4連接酶連接，連接過夜。
15ul 目標DNA片段（如果使用20ul，則14ul就可以）
2ul 線性化質(zhì)粒（如果使用50ul，3ul質(zhì)粒）
2μL 10x NEB T4 DNA ligase buffer
1μL NEB T4 DNA連接酶
（16度 連接過夜）
8轉(zhuǎn)化
[ 基本原理 ]
將質(zhì)粒 DNA 導入細菌的過程稱為轉(zhuǎn)化（ Transformation ）。此感受態(tài)細菌細胞在 CaCl 2 低滲溶液中膨脹為球狀（感受態(tài)細菌的制備，見前）。質(zhì)粒 DNA 與 CaCl 2 形成抗 DNase 羥基 - 磷酸鈣復合物黏附于細菌表面，經(jīng) 42℃ 短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收 DNA 復合物。在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。被轉(zhuǎn)化的細菌中，外源基因得到表達。在選擇性培養(yǎng)平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子（即含有質(zhì)粒 DNA 的細菌）。鈣處理的感受態(tài)細胞，一般每微克 DNA 能獲得 10 5 ～ 10 6 個轉(zhuǎn)化子。除化學方法轉(zhuǎn)化細菌外，還有電穿孔法（ Electroporation ），其轉(zhuǎn)化率可高達 10 9 ～ 10 10 個轉(zhuǎn)化子 /μg 質(zhì)粒 DNA 。
[ 器材 ]
1 ．培養(yǎng)皿 2 ．恒溫培養(yǎng)箱
[ 試劑 ]
1 ． LB 培養(yǎng)基
2 ．選擇性 LB 瓊脂培養(yǎng)平板（含氨芐青霉素，終濃度為 50μg/ml ）
3 ．氨芐青霉素 100 mg/ml
4 ．宿主細菌：經(jīng) 100 mmol/L CaCl 2 處理的感受態(tài)細菌 DH5α
[ 操作步驟 ]
? 取 50 μL 大腸桿菌感受態(tài)細胞，加入適量質(zhì)粒（全部的連接產(chǎn)物 ）冰浴 30 min 后， 42℃ 熱激 70 s ，馬上放回冰上，冰浴 5 min ；加 1ml LB 培養(yǎng)基（無Amp），于 37℃ 搖床慢搖振蕩培養(yǎng) 60 min ；3000rpm 4min離心，倒掉上清，下面的沉淀物混勻涂板。取 50-100 μL 涂在含有氨芐青霉素（ 100 μg/mL ）的 LB 固體培養(yǎng)基上， 37℃ 倒置培養(yǎng)過夜。（如果涂上去的液體過多，則正置1h后倒置。
9 挑克隆
每個樣品挑5個克隆 、ep管中加10uldd水 挑入克隆捶打混勻。取出八連管：
mix ：10ul
Flag-R：1ul ;
GFP-F：1ul ;
克隆混合液：3ul ;
程序
pcr：95 3min
95 15s
56 15s
72 90s
72 10min
4 持續(xù)
2-4 30個循環(huán)
完成后看切的條帶大小，一般跑膠，在皮曝光機器下看，與自己目的蛋白一樣大小的kb帶出現(xiàn)則提示連接成功。注意marker的選擇。
然后將剩余7ul的克隆混合液加入amp的lb培養(yǎng)基800ul的樣子 在搖床中搖 。
跑完膠后發(fā)現(xiàn)正確的條帶后，將搖床上正確條帶的菌群，轉(zhuǎn)移到15ml的搖菌管，搖菌過夜。
10 抽取質(zhì)粒DNA，送去測序，獲得正確組裝質(zhì)粒。
測序引物
先測反向：
pFlag-CMV-R： GCACTGGAGTGGCAACTT（自己合成）
再測正向：
CMV-Forward
21mer 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3（公司有免費通用）
