二代測序大體流程
sample preparation
- 超聲波打斷DNA成300-500bp（人類）加PE adapter（雙端測序primer結(jié)合位點(diǎn)）
- index1和index2（為區(qū)分雙端測序的是否為同一序列）
- p5 tail和p7 tail（與lane中的接頭互補(bǔ)，為后面形成橋式連接的基礎(chǔ)）
上樣
- DNA片段在flowcell的lane中進(jìn)行流動(dòng)吸附
- 每個(gè)序列首次只能與lane中的P5'相結(jié)合
橋式PCR
- p5 ---> p7方向合成一條固定于lane p5上的互補(bǔ)鏈
- 去雜：加入NaOH強(qiáng)堿性溶液使雙鏈DNA變性，互補(bǔ)鏈由于和lane上短序列強(qiáng)力連接固定住了；模板鏈?zhǔn)チ穗p鏈氫鍵連接，好似懸空，它會(huì)被洗脫
- 橋式形成：加入緩沖溶液，互補(bǔ)鏈的p7’和lane上的p7互補(bǔ)，目的是快速擴(kuò)增lane p7接頭連接的鏈，它和我們的模版鏈?zhǔn)且恢碌?。我們后來測序只用這一半
- 橋式PCR：大約35個(gè)循環(huán)后，最終每個(gè)DNA片段都將在各自的位置上集中成束，稱為cluster，這是一群完全相同的序列。目的在于實(shí)現(xiàn)放大單一堿基的信號(hào)強(qiáng)度，滿足后期測序需求
- 解鏈： 橋式PCR完成后，形成了很多的橋形的互補(bǔ)雙鏈，再次強(qiáng)堿解鏈。這一次不再進(jìn)行復(fù)制，而是利用一種酶--甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）選擇性的切掉lane 上p5‘ 連接的鏈，只留下了與lane p7連接的鏈即Forward Strand。測序只用固定在p7上的一條鏈。
sequencing
- 邊用帶有熒光的堿基合成序列，邊進(jìn)行熒光掃描測序
- 一個(gè)熒光堿基結(jié)合上去之后，會(huì)加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并使dNTP 3’ 疊氮基團(tuán)變成羥基，使其不發(fā)光。
- 接下來再加帶有熒光堿基的緩沖液，進(jìn)行下一輪
- Index測序： 上面的循環(huán)結(jié)束后，read product被沖掉，index1 primer和鏈上的index1 互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)行index1的檢測。測完后，洗脫產(chǎn)物，得到index1 的序列。接下來p5與lane上的p5‘配對(duì)，測得了index2，并洗脫
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雙端測序之Reverse Strand學(xué)習(xí)小組Day7筆記--劉洪.png
學(xué)習(xí)小組Day7筆記上--劉洪.png
學(xué)習(xí)小組Day7筆記下--劉洪.png
