官方文檔： https://biognosys.com/media.ashx/spectronautmanual.pdf
0. 準(zhǔn)備
Spectronaut軟件是蛋白組DIA分析最常用的譜圖解析軟件之一，優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是高額收費(fèi)，window版本，速度慢。一起來簡單了解下用法。
這是它的界面。只要理解了DIA流程，用法其實(shí)很簡單，首先構(gòu)建譜圖庫，或者導(dǎo)入已建好的DDA譜圖庫，再導(dǎo)入DIA原始文件，配置好參數(shù)，最后run即可。
一開始需要準(zhǔn)備的是各種數(shù)據(jù)，包括：DIA的rawdata，DDA的rawdata，DDA的database（若有，需加入iRT序列進(jìn)行校正），DDA的搜庫鑒定結(jié)果。如果樣本數(shù)多的話，這些原始文件會非常大，剛也提到該軟件只支持windows系統(tǒng)，轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)很麻煩，隨便一個項(xiàng)目就能達(dá)到500G，所以必須要用很大的內(nèi)存和硬盤。轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)往往要花費(fèi)很長時間。
1. 譜圖庫構(gòu)建
首先進(jìn)入Library，導(dǎo)入譜圖庫。Generate Library from Pulsar...是說用Spectronaut構(gòu)建譜圖庫；Generate Spectral Library from...是說從別的搜庫軟件構(gòu)建好的譜圖庫導(dǎo)入，支持常見的搜庫軟件結(jié)果文件：
Import/Exprot Spectral Library是導(dǎo)入導(dǎo)出譜圖庫，這里的譜圖庫是說已經(jīng)在Spectronaut中完成了的庫。
我們通常是自己導(dǎo)入搜庫軟件的結(jié)果文件來構(gòu)建譜圖庫。
若導(dǎo)入MaxQuant構(gòu)建的譜圖庫：
導(dǎo)入MaxQuant結(jié)果，只需指定combined文件夾導(dǎo)入，軟件會自動關(guān)聯(lián)相對應(yīng)的原始數(shù)據(jù)（DDA的rawdata，關(guān)聯(lián)也需要一段時間），若原始數(shù)據(jù)與搜庫結(jié)果不在同一個文件夾內(nèi)，可能會導(dǎo)致關(guān)聯(lián)失敗，可以通過“Assign Shotgun Files”的方式來指定相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)(見下圖)；關(guān)聯(lián)后，在FASTA Files一欄選擇相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫文件（數(shù)據(jù)庫要右擊上傳，然后點(diǎn)擊左邊倒三角）；點(diǎn)擊”Load”后加載Ion library，導(dǎo)入譜圖庫需要一段時間。
導(dǎo)入成功后，左邊Spectral Libraries會顯示出來。點(diǎn)擊左側(cè)spectral libraries的名字，更改為相應(yīng)的項(xiàng)目編號；右側(cè)顯示的為spectral library的詳細(xì)信息。
若導(dǎo)入Mascot結(jié)果作為譜圖庫：
Mascot的結(jié)果通常是dat文件，每一個rawdata對應(yīng)一個dat。但是Spectronaut要求dat文件名與對應(yīng)的raw文件同名，即使Assign shotgun files指定rawdata路徑，也會關(guān)聯(lián)不到，而且要將所有的dat構(gòu)建一個譜圖庫（這是我們想要的）需要將不同的dat文件整合到同一目錄下，實(shí)際上，一個樣本往往多個fraction，同個樣本的多個dat文件一般放在一個目錄中，所以我們要拷貝出來，重命名。如果樣本數(shù)多，也是件麻煩的事情。
比如原來每個樣本的6個fraction是這樣的結(jié)構(gòu)：
最后需要在同級目錄下同時存在：
然后導(dǎo)入全部dat文件，會自動關(guān)聯(lián)對應(yīng)的rawdata，上傳數(shù)據(jù)庫，設(shè)置參數(shù)即可構(gòu)建譜圖庫了。
常見參數(shù)如下，一般默認(rèn)就好。
另外還有一點(diǎn)，根據(jù)上傳的數(shù)據(jù)庫類型進(jìn)行解析。主要是要注意fasta序列的ID及其后面的描述信息等，因?yàn)椴煌瑏碓吹臄?shù)據(jù)庫，規(guī)則會不同。
導(dǎo)入的數(shù)據(jù)庫格式需要是fasta后綴，fa后綴會識別不了。對于蛋白組來說，大部分?jǐn)?shù)據(jù)庫類型都是uniprot（軟件已經(jīng)給你制定好了，無需定制），若是其他的類型，導(dǎo)入后，根據(jù)數(shù)據(jù)庫制定規(guī)則，不會的可以點(diǎn)擊后面的小問號，最后add rule。
import數(shù)據(jù)庫后，記得打勾選中。
最后點(diǎn)擊右下角的load，即導(dǎo)入譜圖庫，導(dǎo)庫的過程可能需要話一段時間。構(gòu)建譜圖庫的過程可以在日志文件中查看：
以下是完成后譜圖庫的信息：
2. DIA解析
舊版本可能是切換到“Review”界面，點(diǎn)擊“Load Raw from File”后導(dǎo)入DIA數(shù)據(jù)。新的版本是Analysis界面，然后點(diǎn)擊set up a DIA analysis from file，將DIA原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入：
然后選擇譜圖庫：
后面的參數(shù)默認(rèn)就好，一步一步點(diǎn)擊next。直到要設(shè)置condition實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)這一步。需要注意的是圈出來的這幾部分，對照組及重復(fù)設(shè)置。當(dāng)然也可以設(shè)置好后導(dǎo)入。
設(shè)置condition和replicate的參數(shù)來判斷是成對還是非成對，原則是：相同的實(shí)驗(yàn)對象Replicate編號一致，不同的實(shí)驗(yàn)對象Replicate編號務(wù)必不同。如下：
一直點(diǎn)到最后finish，然后一個數(shù)據(jù)一個數(shù)據(jù)的開始提峰。
數(shù)據(jù)量大的話，提峰很慢，因?yàn)橐饩矸e混合譜圖?？赡芤壬蟼€幾天。
3. 結(jié)果導(dǎo)出
提峰完成后，首先是保存工程文件，以sne為后綴。注意是右擊下面這個地方，然后save as：
Spectronaut一旦關(guān)閉，完成的結(jié)果便會丟失，通過保存工程文件，后續(xù)如有重新查看的需求，只需導(dǎo)入工程文件即可，無需重新運(yùn)行spectronaut。
然后是結(jié)果的保存。切換到Report標(biāo)簽界面。
你的軟件可能沒有配置好的如下導(dǎo)出結(jié)果格式，這個主要是為后續(xù)定量分析的軟件使用準(zhǔn)備，如R包MSstat。
一般只有BGS factory report，這時需要自己設(shè)置格式?？梢詫olumns進(jìn)行選擇，也可以filters過濾一些蛋白。當(dāng)然你也可以全部選中，導(dǎo)出后再處理。
可以對新建立的格式做保存，下次就可以直接用啦。比如下面我對所有列都做了選中（打勾），再save as，命名，點(diǎn)ok：
最后，export report導(dǎo)出：
對于MSstats R包，需要導(dǎo)出2種格式文件，一是如下：
二是蛋白定量文件，導(dǎo)出并命名為PG_Report.xls：
當(dāng)然也可以導(dǎo)入或?qū)С鲋贫ê玫母袷?，比如我?dǎo)入：
不過有個小問題，貌似自己制定的和外部導(dǎo)入是由不同的，也就是說這個藍(lán)色陰影和打勾效果不一樣，導(dǎo)入的格式和BGS factory report似乎是同一級別的，而上面新建格式只是在BGS factory report的子文件而已。
根據(jù)導(dǎo)出的結(jié)果看，自己新建的好像不行（這里沒有探究清楚）。
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不論如何，我們導(dǎo)出結(jié)果。
最后的導(dǎo)出的文件包含如下，包含了工程文件、結(jié)果文件、參數(shù)及日志等：
重新導(dǎo)出結(jié)果
如果需要重新加載提峰的結(jié)果，可以在“Analysis”界面（舊版Review界面）選擇“Load a spectronaut Experiment”，選擇相應(yīng)的sne文件進(jìn)行加載。
