分析范圍實(shí)例詳解二：真菌與宿主互作的分子機(jī)制--菌根共生
此次講解的文章信息如下：
Title：Dual RNA-seq reveals large-scale non-conserved genotype × genotype-specific genetic reprograming and molecular crosstalk in the mycorrhizal symbiosis
Accepted Date：11 December 2018
Published Journal ：The ISME Journal（IF: 9.493）
Author：第一作者：Ivan D. Mateus，Department of Ecology and Evolution,University of Lausanne(洛桑大學(xué)),Biophore Building, 1015 Lausanne, Switzerland(瑞士)
1.主要亮點(diǎn)內(nèi)容：WGCNA還可以用來分析兩個(gè)物種之間的關(guān)聯(lián)性？
2.數(shù)據(jù)
2.1樣本：作者設(shè)計(jì)了雙因素實(shí)驗(yàn)，總共15個(gè)樣本
木薯品種：CM6438-14, COL2215, BRA337, CM4574-7, CM523-7 ，每個(gè)品種三株。
真菌因素：三組，DAOM17978，B1，mock(對(duì)照)，每一組處理包含五個(gè)木薯品種
說的有點(diǎn)繞，來個(gè)一圖看懂?dāng)?shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
2.2測(cè)序數(shù)據(jù)
1.選取每一株植物的幾個(gè)細(xì)根須(several fine root samples)
2.提取RNA
3.建庫(kù)
4.上機(jī)測(cè)序:針對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分別比對(duì)真菌參考基因組和木薯物種參考基因組得到兩份表達(dá)數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。
2.3表型性狀，用到了以下性狀:
- Fungal colonization
- Aboveground plant dry weight (g)
- Fine roots plant dry weight (g)
- Tuberized roots plant dry weight (g)
- Total plant dry weight (g)
- Belowground plant dry weight (g)
- Height (cm)
數(shù)據(jù)如下（由于篇幅有限，截取部分樣本展示，完整數(shù)據(jù)在文章Supplementary data2）：
3.結(jié)果
這篇文章主要用WGCNA做了：
1.挖掘出與植物基因和性狀相關(guān)的模塊，總共識(shí)別出了9個(gè)模塊。
注意點(diǎn)：這里作者用來做WGCNA分析的基因是前面做差異表達(dá)分析的并集。
we used the pool of cassava genes that were significantly differentially expressed between the two AMF treatments and the nonmycorrhizal treatment to build cassava gene modules.
2.挖掘出與真菌基因和性狀相關(guān)的模塊，總共識(shí)別出了20個(gè)模塊
注意點(diǎn)：與前面用差異基因并集不一樣，這里采用的是全部的真菌相關(guān)基因。
Because AMF can only be grown in presence of the host plant, we could not select AMF genes that were only involved in the symbiosis. In order to obtain a set of fungal transcripts in non-symbiotically growing fungal material would require germinating spores and sequencing their transcriptome. This would have to be done in a different environment to which these experiments were conducted and would not serve as an appropriate control for detection of true symbiotically-upregulated genes. We, therefore, selected all the R. irregularis genes in the dataset in order to build R. irregularis gene modules.
由于作者比較關(guān)心真菌與木薯之間的共生分子機(jī)制，因此特別關(guān)注了fungal colonization這個(gè)性狀識(shí)別出的兩個(gè)顯著相關(guān)的真菌基因模塊，F(xiàn)_black（cor=-0.54,pvalue=0.002）和F_royalblue(cor=-0.59,pvalue=0.0006)；木薯基因中P_magenta模塊（cor=-0.49,pvalue=0.006）。然后，根據(jù)GS值，挑選出模塊中的‘’key gene“，每個(gè)模塊中的key gene以及相關(guān)的功能展示如下。
其中，我們可以看到F_black模塊中的a fungal chitin synthase（真菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)合成酶）和p_magenta模塊中a plant sucrose synthase （植物的蔗糖合酶）功能相關(guān)基因與the fungal colonization 關(guān)聯(lián)，而植物糖的運(yùn)輸正是真菌共生體內(nèi)碳水化合物分配的重要環(huán)節(jié)。
3.利用WGCNA中的相關(guān)性方法將植物模塊和真菌模塊聯(lián)系起來來挖掘菌根互作的共生機(jī)制。原文如下：
We associated the modules between the two organisms by measuring the Pearson correlation between cassava module eigengenes and R. irregularis module eigengenes using the default WGCNA ‘relating modules to external information’ analysis.
這個(gè)就是全文用WGCNA的一個(gè)主要的亮點(diǎn)了，借用了WGCNA的功能將了兩個(gè)物種之間的模塊關(guān)聯(lián)起來。圖中紅色的點(diǎn)表示真菌基因模塊，綠色的點(diǎn)表示木薯基因模塊，邊表示這兩個(gè)模塊之間有顯著關(guān)聯(lián)。
隨后，作者將兩個(gè)物種中有關(guān)聯(lián)并且與表型性狀有顯著關(guān)系的子網(wǎng)提出來進(jìn)行了生物學(xué)意義的解讀。如下圖，我們可以看到真菌相關(guān)的模塊和木薯相關(guān)的木塊緊密的聯(lián)系在一起，在這些緊密鏈接的模塊中，我們看到了與細(xì)胞骨架的形成（cytoskeleton formation），細(xì)胞組織（cell organization ），肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白基因（actin and myosin genes）功能相關(guān)的key gene。
對(duì)于發(fā)現(xiàn)的這些生物學(xué)過程，arbuscule formation inside the plant cells已經(jīng)得到了廣泛的研究, 而關(guān)于cellular organization 和 cytoskeleton在共生的晚期階段的變化還很少有研究。
總結(jié)：
技術(shù)點(diǎn)：作者選用相關(guān)基因進(jìn)行WGCNA的時(shí)候，是根據(jù)自己實(shí)際情況做了篩選，比如用于分析真菌模塊的基因和用于分析木薯模塊的基因選取策略就不一樣。
生物學(xué)角度：作者用一套測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)兩個(gè)參考基因組得到兩個(gè)物種相關(guān)的表達(dá)數(shù)據(jù)，然后分別進(jìn)行WGCNA模塊挖掘，最后分析了兩個(gè)物種模塊之間的關(guān)聯(lián)性，以此揭示了真菌與宿主之間的一個(gè)分子生物學(xué)的共生機(jī)制。
這種分析思路也是可以用到真菌與其他的宿主比如真菌感染小鼠和人的分子生物學(xué)機(jī)制挖掘的喲~
本文作者：信你個(gè)鬼
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