一、實(shí)驗(yàn)材料
主要試劑及儀器
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞交聯(lián)：
a. 用1ml PBS重懸細(xì)胞；
b. 加28ul 37%甲醛（終濃度為1%）進(jìn)行交聯(lián)，室溫翻轉(zhuǎn)孵育10min；
c.加入10×甘氨酸至終濃度為1×；室溫翻轉(zhuǎn)孵育5min，終止交聯(lián)；
d.?4℃，3000g，離心3min；棄上清液；
e.? 用1ml預(yù)冷的1X
PBS重懸細(xì)胞，用3000g，4℃，5min離心，去上清。
f． 重復(fù)e步驟一遍（此步驟沉淀可凍存于-80℃）；
2. 胞核制備和染色質(zhì)碎裂：
a. 用200ul Membrane
Extraction Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制劑)重懸細(xì)胞；冰上靜置10min；
b.4℃，3000g，離心3min；棄上清液；
c. 用200ul MNase Digestion
Buffer （使用前加入0.2ul DTT）重懸細(xì)胞核;
d. 加入0.2ul MNase ,吹打混勻；37℃水浴30min，期間5min混勻一次；
e. 加入20μL MNase Stop Solution；混勻后冰上放置5min;
f. 4℃，9000g，離心5min；棄上清液；
g. 用100μL of 1X IP Dilution
Buffer（使用前加入1ul蛋白酶/磷酸酶抑制劑）重懸沉淀；
h. 冰上超聲打斷5次，每次2min。
i. 4℃,9000g離心5min;轉(zhuǎn)移上清到新的EP管中
3. 免疫沉淀：
a. 取10ul上清作為input,-20℃凍存?zhèn)溆茫?/p>
b. 取90ul上清加入410ul
X IP Dilution Buffer；陽性對照組加入10ul Anti-RNA Polymerase
II Antibody，IP組加入10ug目的抗體；陰性對照組加入2μL
IgG 。
c. 樣本管放到翻轉(zhuǎn)儀4℃翻轉(zhuǎn)過夜孵育；
d. 震蕩混勻Protein A/G磁珠，并取20ul到每個實(shí)驗(yàn)組中；
e. 將樣品置于磁力架上，靜置2min進(jìn)行磁性分離，棄上清；
f. 加入1ml IP Wash Buffer 1，并吹打混勻；置于翻轉(zhuǎn)儀上，洗滌5min；
g．將樣品置于磁力架上，靜置2min進(jìn)行磁性分離，棄上清；
h. 重復(fù)步驟f~g 3次；
i. 加入1ml IP Wash Buffer 2，并吹打混勻；置于翻轉(zhuǎn)儀上，洗滌5min；
j. 將樣品置于磁力架上，靜置2min進(jìn)行磁性分離，棄上清；
4. 洗脫：
a.加入150ul 1X IP Elution Buffer重懸磁珠，37℃震蕩孵育30min；
b.將樣品置于磁力架上，靜置2min進(jìn)行磁性分離，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的EP管中；
c. input樣本中加入150ul 1X IP Elution Buffer；
d.各樣本中分別加入6μL? NaCl(5M)、2μL 蛋白酶K(20mg/Ml);
e.?65℃孵育2h;
f. 使用 DNA 純化離心柱從樣品中純化DNA。
g. 純化的DNA凍存于-20℃；用于qPCR驗(yàn)證或測序；
5. qPCR檢測:
a. 將Mix在4℃下融解，輕柔地上下顛倒混勻并進(jìn)行短暫離心；
b. 冰上配制下表中的反應(yīng)液：
成分加入量終濃度
HieffTM qPCR? SYBR? Green Master Mix (low Rox)5μL1×
Forward Primer(10μM)0.2μL0.2 μM
Reverse Primer(10μM)0.2μL0.2 μM
DNA2μL?
RNase-free? Waterto 10μL?
c. 將反應(yīng)管進(jìn)行短暫離心，確保所有反應(yīng)液在反應(yīng)孔底部。
d. 采用三步法程序進(jìn)行反應(yīng)：
循環(huán)數(shù)步驟溫度時間熒光采集
1預(yù)變性95℃5minNo
40變性95℃10sNo
退火60℃30sYes
上述反應(yīng)結(jié)束后，從60℃～95℃過程中進(jìn)行熔解曲線分析
6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
a．CHIP-qPCR柱狀圖:
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?CHIP-陽性質(zhì)控
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?CHIP-qPCR
b.CHIP片段化圖：
附件：
GAPDH promoter-FTACTAGCGGTTTTACGGGCG
GAPDH promoter-RTCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA
?
