1.探針的設(shè)計(jì)與合成
根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的p8基因cDNA全長(zhǎng)序列，用premier primer5.0設(shè)計(jì)引物p81和p82，以鹵蟲cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到346bp的產(chǎn)物，回收純化。
引物編號(hào)引物序列長(zhǎng)度
p81TGCGGACGAAACAGGAAG18 bp
p82GCTCAAACAGTGATGCCAGT20 bp
目的片段克隆
1）在無(wú)菌離心管中加入連接載體的各種成分，載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8，根據(jù)凝膠電泳檢測(cè)后的濃度及載體與片段分子大小來(lái)計(jì)算摩爾比。加入成分及比例如下：
目的PCR片段????5 μl
pGM-T載體（約50ng/uL）1 μl
10×T4 DNA Ligation Buffer??1 μl
T4 DNA Ligase（3U/uL）??1 μl
無(wú)菌去離子水3 μl
總體積??10 μl
2）輕輕彈動(dòng)離心管以混合內(nèi)容物，短暫離心。置于PCR儀中16℃過(guò)夜連接，反應(yīng)結(jié)束后將離心管置于冰上。
3）向鋪好的含有氨芐青霉素的固體平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal（20mg/ml），使用無(wú)菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開，避光置于37℃培養(yǎng)箱1-3小時(shí)，使溶解X-gal的二甲基甲酰揮發(fā)干凈。
4）將10 μl的連接產(chǎn)物加到100 μl DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴半小時(shí)，將離心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分鐘，其間不要搖動(dòng)離心管。向離心管加入500 μl 37℃預(yù)熱的LB（不含抗生素）培養(yǎng)基，150rpm搖床37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。將菌液于4000g下離心10分鐘，去掉上清，加入100 μl培養(yǎng)液重溶并加入到配制好的LB固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的彎頭玻璃棒輕輕將細(xì)胞均勻涂開。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。
5）挑取白色菌落直接進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選轉(zhuǎn)化子。
6）將轉(zhuǎn)化子接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，吸取1mL菌液送至大連寶生物公司進(jìn)行序列測(cè)序。
重組質(zhì)粒的線性化
取6 μl以測(cè)序的重組質(zhì)粒，選取NcoI內(nèi)切酶37℃酶切4h。酶切反應(yīng)體系為20 μl：
質(zhì)粒????6 μl
10xK Buffer?2 μl
NcoI酶1 μl
0.1% BSA2 μl
滅菌水9 μl
終體積??20 μl
取酶切前后的質(zhì)粒各4 μl，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，確認(rèn)酶切完全，將酶切產(chǎn)物用Takara膠回收試劑盒回收純化，作為探針合成的模板。
探針合成
按試劑盒使用指南，標(biāo)記反義RNA探針。
使用的所有試劑和器皿均經(jīng)去RNase處理，合成方法如下：先準(zhǔn)備反應(yīng)體系。冰上向RNase-Free的微離心管中順序加入下列試劑:
純化的線形質(zhì)粒1 μg
Rnase-free dH2Oup to 13 μl
10xNTP labeling mixture2 μl
10xTranscription buffer2 μl
Rnase inhibitor??1 μl
SP6 RNA Polymerase?2 μl
總體積??20 μl
稍混勻，短暫離心將反應(yīng)液集于管底，37℃ 2 h。反應(yīng)結(jié)束后再補(bǔ)加2 μl DNase I，37℃ 15 min，反應(yīng)結(jié)束后加入0.2M EDTA 2 μl 終止反應(yīng)。取3-5 μl 反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.石蠟切片的制備
◆本實(shí)驗(yàn)在雜交結(jié)束前均必須保證RNase-free.玻璃器皿采用180℃烘烤10小時(shí)。其它采用DEPC處理，高溫滅菌鍋高溫降解DEPC。若儀器不能高溫處理，可用3%的H2O2處理半小時(shí)以上，DEPC水沖洗干凈，烘干。
組織的固定與包埋
選取不同發(fā)育時(shí)期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的鹵蟲，經(jīng)DEPC處理水沖洗表面鹽分后，加入新鮮配制的4%多聚甲醛，于4℃固定5-8
h，再分別按下列順序進(jìn)行脫水、透明和包埋: 30%乙醇脫水1 h，50%乙醇脫水1 h，70%乙醇脫水1 h，80%乙醇脫水乙醇脫水1
h，90%乙醇脫水1 h，無(wú)水乙醇脫水1 h，無(wú)水乙醇脫水1 h，無(wú)水乙醇:二甲苯(1:l)透明10 min，二甲苯透明10
min、二甲苯:54℃石蠟(1:1)浸蠟30 min，54℃石蠟浸蠟1 h，54℃石蠟包埋。
組織切片：將包埋的組織按7 μm的厚度切片，在多聚賴氨酸處理的載玻片上滴加DEPC處理水，組織片于42℃展片臺(tái)上展片1小時(shí)，再置于40℃恒溫箱中烘片12小時(shí)后放于4℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>
3.雜交前處理
切片經(jīng)二甲苯脫蠟2×15 min，無(wú)水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30%乙醇脫水各5 min，后DEPC處理水2×5 min，然后進(jìn)行雜交前切片處理，具體步驟如下:
lxPBS(pH7.4)室溫孵育2×5 min。
3%TtitonX-100的PBS中去膜處理15 min。
lxPBS洗滌2×5 min。
無(wú)RNase的蛋白酶K(20 mg/mL)37℃消化30 min。
100mMGly/PBS中洗2×5 min。
lxPBS洗滌2×5 min。
4%多聚甲醛(4℃)固定5min。
lxPBS洗滌2×5 min。
含有25%(W/v)的乙酸酐的100mM的三乙醇胺緩沖液(pH8.0)去電荷處理15 min(現(xiàn)配現(xiàn)用)。
lxPBS洗滌2×5 min。
4.預(yù)雜交和雜交
滴加預(yù)雜交液于載玻片上，然后置于濕盒中，50℃預(yù)雜交2小時(shí)。
棄去預(yù)雜交液，立即滴加雜交液，置于濕盒中52℃雜交過(guò)夜。
5.雜交后處理
雜交完，以后的步驟不必要特意防RNA酶。
棄去雜交液，載片浸入2xSSC中2×15 min。
載片浸入1xSSC中55℃水浴搖動(dòng)2×15 min。
用含20mg/mL的RNaseA的NTE緩沖液37℃消化30分鐘，以去除未結(jié)合的探針。
載片浸入5xSSC中55℃水浴搖動(dòng)2×15 min。
載片浸入5xSSC中室溫10 min。
6.抗體反應(yīng)
用washing buffer清洗組織片5 min。
滴加封閉液緩沖液室溫下處理組織片30 min。
用抗體液覆蓋封閉后的組織片，置于濕盒中孵育3h以上。
Washing buffer 洗2×15 min。
Detection buffer 中平衡2-5 min。
7.顯色：加入顯色液于濕盒中黑暗靜止顯色16h
8.封片與觀察：
顯色合適時(shí)，用TE buffer終止著色反應(yīng)，再用蒸餾水清洗。
滴加封片劑封片，顯微鏡下觀察和攝影。
