設(shè)計引物
引物長度一般在15~30 bp，最常用的是18~27bp；
引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好在72℃左右。Tm值簡單粗暴的計算方法為Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，或在此基礎(chǔ)上減5℃；
引物3’端不能選擇A，最好選擇T，G/C的錯配率介于A/T之間；
以上為最主要的原則，另外還要注意引物的特異性、引物內(nèi)部不能形成二級結(jié)構(gòu)等原則，具體可以百度之；
CDS的獲取
獲取一個基因CDS序列的方法如下：
打開NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov），如下圖，按照順序，在1處選擇Nucleotide，在2處輸入“PDCD1”，點擊3處的Search，等出來結(jié)果之后點擊4處的“Homo Sapiens”進行進一步篩選（如果你要做鼠源的就選Mus musculus，其他種屬選擇相應(yīng)的名稱即可進一步篩選了）
然后第一條就是我們需要的序列信息，點擊進去，往下拉，直到看到CDS（如下圖）
點擊CDS，就出現(xiàn)了下圖中所示內(nèi)容，其中加了底色的部分序列便是我們需要的序列了，可以看到這段序列開頭是ATG起始密碼子，最后三位是TGA終止密碼子。選中這段序列復(fù)制即可。
由于需要PCR整個CDS區(qū)域，所以正反向引物并沒有多少選擇的余地，甚至可以參照上述原則簡單粗暴的從正反向各選擇22個堿基左右作為引物，例如：!
正向引物序列與CDS相同，反向引物序列與CDS互補。另外要注意的是寫引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不會從3’到5’，所以我們的CDS雖然沒有注明方向，但是其實也是5’到3’。
雖然可以這么簡單粗暴的設(shè)計引物，但是還是想借此教大家使用一下引物設(shè)計的經(jīng)典軟件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下圖，首先點擊File->New->DNA Sequence，
然后點擊空白處Ctrl+V粘貼我們的CDS序列，選擇As is，即我們復(fù)制的是什么樣的序列就粘貼的什么樣的序列。
下面的依次是“反向序列粘貼”、“互補序列粘貼”“反向互補序列粘貼”。
點擊左上角的Primer，如下圖，S=Sense，A=Antisense
如果對現(xiàn)在的引物不滿意，還可以點擊Edit Primers編輯序列，如下圖，我們刪除掉末尾三個堿基，之后需要先點擊Analyse，然后才能點擊OK，我們可以看到正向引物已經(jīng)從25個堿基變?yōu)?2個堿基了。
最后點擊Edit->Copy->Sense Primer，粘貼到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘貼也會自動變?yōu)?’到3’的序列。所以非常方便。
這樣我們PDCD1用于PCR的正反向引物就初步設(shè)計好了。如果你只是想P出PDCD1這個基因，現(xiàn)在的引物就可以送去合成了，但是如果你想將其構(gòu)建到載體上，那么我們還要對其進行進一步的加工。
Primer 5的使用
根據(jù)不同的目的，可以選擇不同的載體，如過表達（pcDNA 3.0）、敲減（pLKO.1-TRC）、原核純化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包裝（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我們就以過表達載體pcDNA 3.0為例進行講解。
從質(zhì)粒圖譜上可以看到多克隆位點有多個酶切位點可以選擇，那是不是每個位點都可以用呢？當然不是！我們要選擇那些PDCD1（或其他目的基因）本身沒有的酶切位點！
所以我們還需要用Primer 5來分析一下哪些是PDCD1所沒有的。
還是打開Primer 5，然后粘貼CDS序列，點擊Enzyme，2為所有的酶，我們比對質(zhì)粒圖譜選擇多克隆位點的酶，雙擊即可到3的框中，選好之后點擊OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI兩個酶切位點，所以這兩個不可以選，其他的都可以選。
不過一般選擇常用好用的最好是實驗室就有現(xiàn)成的那些酶了。比如我們選擇EcoRI和XhoI，那么我們就可以在對引物加上相應(yīng)的酶切位點了。
于是我們得到如下引物：
好了，我們現(xiàn)在就可以將這些引物送去相應(yīng)公司合成了。
質(zhì)粒構(gòu)建
終于到正題了！
待引物合成之后，我們用ddH2O將其稀釋到100 μM作為母液，取一些稀釋到10 μM做下一步實驗了。
首先我們P出目的基因，這一步建議用高保真PCR酶，小編常用的是Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下圖：
模板的獲取
找到表達（最好高表達）該基因的細胞或者組織，用TRIzol法抽提RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到相應(yīng)的cDNA作為模板；
免費索取。給大家推薦一個可以免費索取cDNA的地址：http://hanlab.xmu.edu.cn。韓家淮院士為大家免費提供cDNA，只需要進入該網(wǎng)址點擊左側(cè)導(dǎo)航欄的“****cDNA索取”即可免費獲取韓家淮院士實驗室的cDNA了！
PCR完成之后跑1%的膠回收目的片段，也可以直接用PCR Clean試劑盒回收。回收之后將其雙酶切，同時需要酶切適量載體。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，還可以打開網(wǎng)址http://t.cn/RVuwBVo查詢雙酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之后的片段進行連接，小編使用的是Thermo公司的T4連接酶，體系如下：
現(xiàn)在的T4連接酶基本都是快酶，比如Thermo的這款聲稱10 min就可以連接完成，不過小編保險起見，一般連接30 min，切勿連接過夜！
連接完成之后便是轉(zhuǎn)化，挑菌（單克?。?，搖菌抽提質(zhì)粒，送去測序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比較成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比較穩(wěn)定且廣泛應(yīng)用的，當然現(xiàn)在一些國產(chǎn)的TRIzol類產(chǎn)品也能滿足大部分情況下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事項及原理
注意事項：
1、RNA酶（RNase）非常穩(wěn)定，是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后又會迅速復(fù)性。用常規(guī)的高溫高壓蒸汽滅菌法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關(guān)的分子生物學(xué)實驗時，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部。提取RNA時使用專門的RNase-free的槍頭和離心管。
2、TRIzol試劑具有較強毒性，如沾到皮膚立刻用大量的清潔劑和水沖洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol試劑：TRIzol能在破碎細胞、溶解細胞內(nèi)含物的同時保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。異硫氰酸胍，是一種強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。
2、氯仿：氯仿可增強TRIzol中的8-羥基喹啉對RNase的抑制作用。另外氯仿作為有機溶劑，加入氯仿后離心可使溶液分層，上層為水相，下層為有機相。苯酚為弱酸性，酸性條件下（一般為Ph5.0）DNA和蛋白質(zhì)進入有機相，而RNA留在水相；反之亦然，弱堿性（Ph8.0）時DNA留在水相。
3、異丙醇、無水乙醇、70%乙醇：異丙醇和乙醇能與水任意比例互溶，因此加入異丙醇能夠奪取RNA周圍的水分，使其脫水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化學(xué)修飾劑，它與RNase的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制其活性。DEPC有毒性，操作時應(yīng)小心。誰說是最優(yōu)秀的；誰是最自由的，誰也就是最優(yōu)秀的，在他們身上，才會有最大的美。
操作步驟
1、細胞破碎
A、組織：按1 mL/50~100 mg組織樣品的比例向打散的組織塊中加入TRIzol試劑，樣品的體積不能超過TRIzol體積的10%。
B、貼壁細胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol試劑，并用移液槍反復(fù)吹吸數(shù)次。TRIzol試劑過少會導(dǎo)致DNA污染。
C、懸浮細胞：懸浮細胞離心收集后，直接按1 mL/5~10×106個細胞（動物、植物或酵母）的比例加入TRIzol試劑。加入TRIzol前不要洗細胞，否則易造成mRNA的降解。
如果樣品中含有較多的蛋白、脂肪、多糖或其他細胞外物質(zhì)，如肌肉、脂肪組織或植物的塊根等，可在2℃~8℃，12000×g離心10 min去除這些物質(zhì)。
關(guān)于TRIzol的用量，Invitrogen官方說明書中有建議用量：
一般情況下，根據(jù)細胞量的多少小編的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（僅供參考）
2、氯仿抽提分層
加入TRIzol后，室溫（15℃~30℃）孵育5 min保證核蛋白復(fù)合體充分解離。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。蓋緊管蓋后劇烈搖晃15s，室溫靜置23分鐘。12000×g，2℃8℃離心10 min，轉(zhuǎn)速不可過高否則會導(dǎo)致RNA斷裂。離心后液體分為三層，下層為紅色的有機相（酚-氯仿），中間為白色的沉淀，上層為無色的水相。RNA在上層水相中，水相的體積約為加入的TRIzol體積的60%。
3、用異丙醇使RNA沉淀
將上層水相轉(zhuǎn)移到一個干凈的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白質(zhì)就保存下層有機相。
加入與水相等體積的異丙醇，室溫孵育10 min。12000×g，2℃~8℃離心10 min。RNA沉淀一般附著在遠離離心機軸心的管底，為無色膠狀。
4、用乙醇洗滌去除殘留的蛋白質(zhì)和無機鹽
去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗滌RNA沉淀。震蕩混勻RNA后，7500×g 2℃~8℃離心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清后，將管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈現(xiàn)半透明狀。不要讓RNA沉淀變成完全不透明，那時RNA完全干燥將會大大影響RNA的溶解。根據(jù)后續(xù)實驗要求加入適量的DEPC水，用移液槍反復(fù)吹吸數(shù)次后。
逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA
一般逆轉(zhuǎn)錄（也可稱作反轉(zhuǎn)錄）都有現(xiàn)成的試劑盒，只要大家按照試劑盒的說明書來操作，問題都不大，在這里小編就以TAKARA的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為例稍加說明。
Random 6 mers為隨機的6核苷酸引物，引物序列為5'-(P)NNNNNN-3'，特點是產(chǎn)物量大，特異性差，適用于長的或具有Hairpin構(gòu)造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在內(nèi)的所有RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)都可使用本引物。
Oligo dT Primer適用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特異性好，但因其只結(jié)合Poly A尾巴，對于較長的mRNA，經(jīng)常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
兩種引物可據(jù)實際情況使用一種，也可同時使用。還有一種情況，當只擴增一種目的基因時，也可以使用Specific Primer（PCR時的下游引物）作為反轉(zhuǎn)錄引物。
操作步驟
步驟簡述如下：按照下圖中1配制溶液，然后65℃處理后加入3中所配制溶液繼續(xù)后續(xù)反應(yīng)即可。
連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
常用的感受態(tài)細胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提質(zhì)粒一般用DH5α，可以自己制備也可以購買商業(yè)化的感受態(tài)。
ABOUT Transformation
注意事項
1. 感受態(tài)細胞要現(xiàn)用現(xiàn)融，剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)轉(zhuǎn)化效率最高；
2. 避免反復(fù)凍融感受態(tài)細胞；
3. 整個操作過程要輕柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受態(tài)和連接產(chǎn)物（或質(zhì)粒）用量要適中，并不是越多越好。
操作步驟
1. 取50 μL感受態(tài)細胞置于冰上融化；
2. 加入5 μL連接產(chǎn)物（質(zhì)粒一般只需用白色槍頭沾取一下即可），混勻，置于冰上靜置30 min（此時應(yīng)該打開水浴鍋并調(diào)溫至42℃）；
3. 42℃水浴中熱激90 s，迅速置于冰上靜置2 min；
4. 加入500 μL無菌的LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃，200rpm的恒溫搖床中培養(yǎng)1 h，使細胞復(fù)蘇；
5. 連接產(chǎn)物：3000 rpm離心5 min，棄上清，留取少量LB（50 μL左右），重懸沉淀，全部均勻涂布于LB培養(yǎng)板（需含相應(yīng)抗生素）上，37℃ 倒置培養(yǎng) 1618h；質(zhì)粒：直接取2050 μL涂于LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)即可。
質(zhì)粒的小量提取
ABOUT 質(zhì)粒抽提
實驗原理：
較常用的質(zhì)粒提取方法有三種：堿裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（<15kb）。去污劑裂解法則比較溫和，一般用于分離大質(zhì)粒（>15kb）。
堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒的方法，其原理為：當細菌暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質(zhì)變性，將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。
由于質(zhì)粒DNA分子比染色體DNA大得多，且前者為共價閉合環(huán)狀分子，后者為線狀分子。只要堿處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復(fù)到中性時，質(zhì)粒DNA雙鏈就會再次形成。
在裂解過程中，細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會互相纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽（SDS）包蓋。
當用鉀離子取代鈉離子時，這些復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來。離心除去沉淀之后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
本方法采用Tiangen小提中量試劑盒進行提取，其純化系統(tǒng)是硅基質(zhì)吸附材料，其原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除，最后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來。得到的質(zhì)粒可以用于酶切、PCR、測序、細菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學(xué)實驗。
實驗試劑（試劑盒試劑配方不清楚，以下配方見《分子克隆實驗指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一個合適的緩沖體系；50 mM葡萄糖可以使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；而EDTA 作為Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，起到了抑制DNase的作用；RNase作用為去除質(zhì)粒中混有的RNA，其不受EDTA的影響。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使細菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包蓋的細菌蛋白，染色體DNA一起作為沉淀析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸
原理：這一步的K+置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時染色體DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和堿，使溶液恢復(fù)中性，從而使質(zhì)粒DNA復(fù)性。
操作步驟
1、將過夜培養(yǎng)的菌液（5-15ml）從搖床中取出，并擰緊蓋子，9000 rpm離心10 min，用泵盡量吸除上清。若暫時不提取，可將沉淀保存于-20℃，也可直接將菌液保存于4℃（短時間）。
注意：如果菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。
2、柱平衡步驟：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中（請使用當天處理過的柱子）。
注意：若柱子放置較久，需要進行這一步驟；否則，可省。
3、向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀，并移至2ml離心管中。如果沉淀的菌體較多，則相應(yīng)增加P1的用量（之后P2和P3的用量也應(yīng)成比例增加），并分到幾個管子中分別進行步驟4和5的操作（不然P1+P2+P3的總體積超過2ml離心管容積），步驟6過上清時可過同一個吸附柱。
注意：菌體量以能夠充分裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會降低質(zhì)粒的提取效率。另外，務(wù)必徹底懸浮細菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。
4、向離心管中加入500μl溶液P2 ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次使菌體充分裂解。由于P2裂解不應(yīng)超過5 min，以免質(zhì)粒受到破壞。故加入P2前將計時器定時4 min，以免超過時間。但是時間也不可過短，以免裂解不徹底。每管操作時間盡量一致。
注意：溫和地混合不要劇烈震蕩，以免污染基因組DNA 。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
5、向離心管中加入700μl溶液P3（記得冰上預(yù)冷），立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8 次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）離心10 min，此時在離心管底部形成沉淀。如果上清量較大，需要多次過柱，可將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，以免沉淀飄起。
注意：P3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
6、將上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量為750-800μl）,注意盡量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、可選步驟：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室溫靜置2-5 min，有助于更好地去除雜質(zhì)。
9、重復(fù)操作步驟8。
10、將吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR 等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置數(shù)min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11、將吸附柱置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300μl洗脫緩沖液EB（65℃預(yù)熱），室溫放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
注意：為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中．重復(fù)步驟
11、洗脫液的pH 值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內(nèi)（可以用NaOH 將水的pH 值調(diào)到此范圍）, pH 值低于7.0 會降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于100μl，體積過小影響回收效率，但也不應(yīng)過大，以免所提質(zhì)粒濃度過低，影響后面的使用。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
結(jié)果判斷
1、使用紫外分光光度計對質(zhì)粒濃度及純度進行測定
（1）檢測波長為260nm和280nm，濃度看OD260，OD260值為1相當于大約50μg/ml；純度看OD260/OD280，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，偏低可能是蛋白質(zhì)污染，偏高則可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，但并不表示純度低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值。另外，測出來的OD260和OD280都應(yīng)該在0.1-2.0之間，不然所得出的濃度和純度不準確。
（2）應(yīng)該注意的是作為空白對照的blank管稀釋方法應(yīng)該和所測樣品管一樣（如樣品為2μl所提質(zhì)粒+48μl ddH2O，則blank為2μl洗脫液+48μl ddH2O）。
2、酶切鑒定，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測
（1）選用合適的內(nèi)切酶對所提質(zhì)粒進行酶切，并與未切質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化用原質(zhì)粒一起用瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)酶切結(jié)果及所提質(zhì)粒與原質(zhì)粒位置是否一致，可以判定所提質(zhì)粒是否為目的質(zhì)粒。
（2）所提質(zhì)粒（未酶切）的電泳條帶可能為一條帶，也可能為二到三條帶，這是因為質(zhì)粒提取過程中操作過于劇烈可能使環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA單鏈出現(xiàn)缺口（保持環(huán)狀，失去超螺旋），或雙鏈斷裂（變成線狀），三種構(gòu)型的質(zhì)粒分子在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率是不一樣的，因此會出現(xiàn)多條帶，這也說明所得質(zhì)粒不夠理想。
測序結(jié)果的分析
構(gòu)建好質(zhì)粒之后我們一般先酶切鑒定，鑒定正確的可以直接拿去轉(zhuǎn)染然后做WB檢測表達即可。
可以正常表達的質(zhì)粒我們需要送到測序公司測序，也可以直接送菌液測序，有些測序公司還提供質(zhì)粒返還服務(wù)（即送菌液返還他們抽提的質(zhì)粒）。
測序的引物一般使用通用引物，如果沒有通用引物需要自行設(shè)計。常用的通用引物如下：
在公眾號內(nèi)回復(fù)“通用測序引物”獲取此Excel！
測序結(jié)果返回之后我們就可以分析測序結(jié)果了。
一般常用的序列比對軟件有DNAMAN和Chromas，當然，還有很多類似軟件，大家可以根據(jù)個人習(xí)慣選擇，在這里就不一一介紹了。
DNAMAN
1. 首先打開軟件，左側(cè)數(shù)字為各個通道的編號，每個通道只能載入一個序列：
2. 然后點擊File->New，將我們目的基因的CDS序列粘貼進去，Ctrl+A全選，右鍵選擇Load Selected Sequence，將序列載入通道1。
3. 選擇通道2（點擊數(shù)字2即可），點擊File->Open打開測序回來的序列信息（后綴為.seq），同樣全選右鍵載入通道2，之后點擊Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在彈出窗口中，點擊Channel，選中需要比對序列的通道，點擊OK即可：
5. 后面基本是一直點擊下一步，在如下圖窗口中選中Try both strands：
6. 然后一直下一步，出來如下結(jié)果，即可比對測序結(jié)果和原CDS序列，如果有突變我們需要看一下是否是同義突變，如果是即質(zhì)粒序列正確。
Chromas
1. 用Chromas軟件打開測序返還的序列信息，然后點擊File->Blast Search:
