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酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)

本文主要講述了畢赤酵母蛋白表達(dá)的原理，畢赤酵母表達(dá)能夠高效表達(dá)的機(jī)制。

巴斯德畢赤酵母(以下簡(jiǎn)稱畢赤酵母）能夠高效表達(dá)外源基因，是因?yàn)槠溆懈鼜?qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，即醇氧,FDF化酶啟動(dòng)子PAOX。甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母能將甲醇分解為甲醛和過(guò)氧化氫，在此反應(yīng)中參與的酶是醇氧化

酶(AOX1和AOX2)。其中，AOX2的表達(dá)量比AOX1低得多，以甲醇為唯—碳源時(shí)，AOX1增至細(xì)胞總蛋白的40%。PAOX1受甲醇誘導(dǎo)和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1的表達(dá)受到甲醇的嚴(yán)格控制。

巴斯德畢赤酵母所表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上，這是通過(guò)把攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒線性化，以同源重組的方式整合到強(qiáng)啟動(dòng)子PAOX1的下游，目的基因一般插入到5’AOX1啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間的單克隆位點(diǎn)。

畢赤酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)

1.酵母表達(dá)宿主菌. Mut+和Muts

在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，乙醇氧化酶有兩種基因編碼，即AOX1和AOX2。細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力有AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表達(dá)的AOX1蛋白提供。當(dāng)AOX1缺失，只存在AOX2時(shí)，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，這種細(xì)胞利用甲醇能力低，在甲醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢的菌株表現(xiàn)型為Mut。存在AOX1，細(xì)胞利用甲醇正常生長(zhǎng)，在甲醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，這種菌株表現(xiàn)型為Mut*，這就是甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)兩種Muts和Mut+產(chǎn)生的原理。

酵母表達(dá)系統(tǒng)常用宿主菌

GS115、KM71、SMD1168是常用的表達(dá)宿主菌，均為甲醇誘導(dǎo)型。他們都是組氦酸缺陷型，如果表達(dá)載體上帶有組氨酸基因，可以補(bǔ)償宿主菌的組氨酸缺陷，所以可以在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選重組轉(zhuǎn)化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，AOX1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)，宿主菌的

AOX1基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，使目的基因大量表達(dá)。

有無(wú)甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的Mut+和Mut5表現(xiàn)型

畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度為28-30℃，誘導(dǎo)期間超過(guò)32℃，不利于蛋白表達(dá)，并可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Mut和Mut*菌株在沒(méi)有甲醇存在的情況下生長(zhǎng)速率一樣，存在甲醇的情況下，AOX1啟動(dòng)子被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，Mut*較?Mut5生長(zhǎng)更快(4-5倍)。

2.酵母蛋白表達(dá)載體

酵母蛋白表達(dá)載體的選擇

酵母表達(dá)產(chǎn)物有胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外表達(dá)兩種方式，這取決于表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建是否帶有信號(hào)肽，可根據(jù)基因表達(dá)的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達(dá)載體。

胞內(nèi)表達(dá)載體:主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。該類載體將目的基因表達(dá)在胞內(nèi)，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達(dá)或不含-S-S-的非糖基化蛋白，較胞外分泌表達(dá)水平高但純化相對(duì)復(fù)雜。分泌到胞外表達(dá)的載體: pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號(hào)序列由89個(gè)氨基酸組成αx交配因子的引導(dǎo)。

多拷貝插入表達(dá)載體: pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達(dá)量。

·表達(dá)重組蛋白使其具體天然的N端

想實(shí)現(xiàn)表達(dá)重組蛋白使其具體天然的N端，將目的基因直接連接在Kex2蛋白酶切位點(diǎn)之后。Kex2蛋白酶切位點(diǎn)在信號(hào)肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置為Kex2蛋白酶的酶切位點(diǎn)

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)機(jī)制/原理

畢赤酵母能夠高效的表達(dá)外源基因，是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)啟動(dòng)子乙醇氧化酶啟動(dòng)子(AOX1和AOX2)。AOX1和AOX2及其產(chǎn)生的Mut和Mut*表現(xiàn)型前文已經(jīng)敘述過(guò)。AOX1受甲醇的誘導(dǎo)和葡糖糖或甘油的抑制。畢赤酵母表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上，通過(guò)把構(gòu)建的質(zhì)粒/載體線性化(主要采用酶切)，通過(guò)同源重組的方式整合到啟動(dòng)子AOX的下游，一般是插入到5’AOX啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)之間的單克隆位點(diǎn)。

畢赤酵母同源重組的方式，見酵母蛋白表達(dá)系統(tǒng)介紹。

酵母蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程

酵母蛋白表達(dá)步驟/實(shí)驗(yàn)流程

本文主要講述了酵母蛋白表達(dá)步驟，詳細(xì)酵母表達(dá)流程。從感受態(tài)細(xì)胞制備，轉(zhuǎn)化方法選擇及操作，從化學(xué)試劑PEG1000轉(zhuǎn)化，電擊轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化三個(gè)方法入手及轉(zhuǎn)化子的篩 選及最終的蛋白表達(dá)，全套酵母蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

質(zhì)粒線性化

在酵母表達(dá)系統(tǒng)中已經(jīng)介紹了酵母蛋白表達(dá)原理，因此線性化是酵母轉(zhuǎn)化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

轉(zhuǎn)化方法

畢赤酵母PEG1000轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備

配置緩沖液

1）緩沖液A:1.0M山梨醇，10mM甘氨酸，pH8.35,3%(v/V)乙二醇，濾膜過(guò)濾，-20℃保存;2)緩沖液B: 40% (w/v)PEG1000，0.2M甘氨酸,pH8.35，濾膜過(guò)濾，-20°℃保存;

3）緩沖液C:0.15M NaCl，10mM甘氨酸，pH8.35，濾膜過(guò)濾，-20℃保存;

4)未污染的新鮮、試劑級(jí)DMSO,-70°C保存

將DNA直接加在凍結(jié)的酵母細(xì)胞上是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵之處(即使在冰上解凍的待轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過(guò)程中迅速下降;樣品的轉(zhuǎn)化，進(jìn)行多組試驗(yàn)。

感受態(tài)制備

1）接種酵母受體菌單菌落于YPD平板(YPD:蛋白表達(dá)試劑配置)，30°℃培養(yǎng)2天;2)挑取平板上的單菌落接種于10mIYPD液體培養(yǎng)基中，30°℃搖床震蕩過(guò)夜;

3)過(guò)夜培養(yǎng)后按1%左右的接種量接種到100mIYPD培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD值從0.1至0.5~0.8;4) 3000~5000rpm離心收集沉淀菌體，用50ml預(yù)冷A液洗滌，并重懸與4mlA液中;

5）根據(jù)每次使用量(0.1-0.2ml左右)分裝與1.5ml離心管中，每管加入10ul的預(yù)冷DMSO，混合后迅速-80℃/液氮（感受態(tài)可以放到-80℃，但是酵母表達(dá)建議感受態(tài)現(xiàn)做現(xiàn)用)

·酵母轉(zhuǎn)化

1)線性化質(zhì)粒50ug (可預(yù)冷）溶于200ul的TE中，直接加入凍存的酵母感受態(tài)中;2) 37°℃水浴5min，過(guò)程混合樣品2次;

3）取出加入1.5ml緩沖液B，徹底混勻;4) 30°C水浴1小時(shí);

5）室溫2000rpm離心10min，去上清，得沉淀，重懸菌體與1.5ml緩沖液C中;6）再次離心，去上清，得沉淀，輕輕加入0.2ml緩沖液C重曇;

7）將重懸的轉(zhuǎn)化液涂與選擇性培養(yǎng)基（根據(jù)抗性配置)中，30℃孵育3-4天，進(jìn)行鑒定。

畢赤酵母電擊感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

感受態(tài)制備

1）接種酵母受體菌單菌落于YPD平板，30°℃培養(yǎng)2天;

2）挑取平板上的單菌落接種于10mlYPD液體培養(yǎng)基中，30°C搖床震蕩過(guò)夜;

3)過(guò)夜培養(yǎng)后按1%左右的接種量接種到100mIYPD培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至OD值1.2~1.5;4) 4℃，5000rpm離心5min收集沉淀菌體，用100ml預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;

5)4℃，5000rpm離心10min收集沉淀菌體，用100ml預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;6)再次4℃，5000rpm離心10min收集沉淀菌體，用100ml預(yù)冷無(wú)菌水重懸菌體;7) 20ml，1mol/L山梨醇洗滌1次;

8）將菌體溶于200ul，1mol/L預(yù)冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置幾小時(shí)，待轉(zhuǎn)化

·酵母電轉(zhuǎn)

1）準(zhǔn)備好80ul的酵母感受態(tài)與線性化的質(zhì)粒1-5ug (冰上預(yù)冷15min)混合，迅速放入0.2cm的電擊杯中(電擊杯冰上預(yù)冷滅菌)，電擊;

2）電擊結(jié)束，迅速加入1ml山梨醇，涂平板（在搖床上培養(yǎng)1h后涂平板也可);3）MD培養(yǎng)基生長(zhǎng)3-4天，ROB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4-5天后，鑒定。

·電擊注意點(diǎn)

1）線性化質(zhì)粒的含量在1-5ug，純度越高越好，量要有保證，很多人找不到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子可以考慮是否是這個(gè)因素造成;

2）感受態(tài)菌液收集，確定OD值在1.2-1.5之間，可以稀釋不同倍數(shù)，判斷是否是線性關(guān)系，菌液渾濁單OD值不高，可能是OD稀釋倍數(shù)不夠;

3）感受態(tài)保存，感受態(tài)制備但其他還沒(méi)處理好，冰上放置的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率也會(huì)有影響，因此還是那個(gè)原則;現(xiàn)做現(xiàn)用;且分裝成每次夠用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染;

4)電擊杯清洗，先洗凈吹干，浸泡在75%乙醇中，使用前超凈臺(tái)紫外滅菌，重復(fù)使用對(duì)實(shí)驗(yàn)也會(huì)有一定影響;5）電擊參數(shù)，電壓及電擊時(shí)間可以摸索，適當(dāng)增加電壓或延長(zhǎng)電擊時(shí)間，電擊過(guò)程冰上操作

畢赤酵母原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化及感受態(tài)制備

·原生質(zhì)轉(zhuǎn)化原理

酵母細(xì)胞具有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁會(huì)組織其對(duì)外源DNA的攝入，因此，去除掉部分的細(xì)胞壁有利于酵母細(xì)胞對(duì)DNA的吸收。利用藤黃節(jié)桿菌酶（為一種葡聚糖酶），可以部分消化細(xì)胞壁。關(guān)鍵在于不能過(guò)度的消化細(xì)胞壁，否則將造成細(xì)胞死亡。藤黃節(jié)桿菌酶的消化能力受到SDS的影響，可以加入SDS對(duì)其消化進(jìn)行控制，以得到消化適度的細(xì)胞。消化獲得70%的原生質(zhì)細(xì)胞時(shí)，效果最好。

·試劑配制

轉(zhuǎn)化當(dāng)天，配制如下溶液:

SE:1M山梨醇，25mM EDTA,pH8.0

SCE: SE: 1M山梨醇，1mM EDTA，10mM檸檬酸鈉緩沖液，pH8.5ssos: 1M山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl2

CaS: 1M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2DTT，PEG: DTT水配制為1M濃度，PEG用水配制40% (w/v)CaT: 20mM Tris pH7.5,20mM CaCl2

⑦藤黃節(jié)桿菌酶:用水配制成3mg/ml的濃度⑧5%SDS溶液，RD融化瓊脂100ml，1M山梨醇每次轉(zhuǎn)化時(shí)配制

SED: 19mlILSE加1ml DTT

PEG/Cat: 1:1混合40%PEG及Cat其他試劑

YPD培養(yǎng)基1L，YPD平板1LRDB平板1L，RDHB平板1L

·感受態(tài)制備及消化細(xì)胞壁

1)接種酵母受體菌單菌落于YPD平板，30°℃培養(yǎng)2天;

2）挑取平板上的單菌落接種于10mIYPD液體培養(yǎng)基中，30℃搖床震蕩過(guò)夜;

3）取培養(yǎng)的細(xì)胞5ul，10ul，20ul分別加入到含有200mILYPD的液體培養(yǎng)基中，30℃C震蕩過(guò)夜(300rpm) ;4)第二天測(cè)每個(gè)培養(yǎng)瓶中的OD600值，并取出事先配置好的轉(zhuǎn)化溶液，室溫放置:

5）收集OD600值在0.2-0.3對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，室溫離心(1500rpm5min左右)，得到沉淀;如果沒(méi)有培養(yǎng)瓶中的OD值在0.3左右的話，選擇一個(gè)培養(yǎng)瓶，用新配置的培養(yǎng)基以1:4稀釋，再次培養(yǎng)(2-3h左右)，直至出現(xiàn)OD值為0.2-0.3，收集細(xì)胞;

6)準(zhǔn)備去除細(xì)胞壁，準(zhǔn)備去壁試劑和待去壁的細(xì)胞;

7)準(zhǔn)備去壁試劑:現(xiàn)配SED，保證DTT(分析級(jí))的新鮮度，配完放-20°℃;

8）準(zhǔn)備帶去壁細(xì)胞:先用滅菌水清洗，轉(zhuǎn)入離心管;1500rpm離心5min，收集細(xì)胞，用20mISED重懸并洗滌離心;再次用1M山梨醇洗滌，離心(同上)﹔用SCE重懸，分開至兩個(gè)離心管中（每管10ml左右);

9）準(zhǔn)備藤黃節(jié)桿菌酶，取―管酶放置冰上，以上準(zhǔn)備的兩管細(xì)胞取出一管加入藤黃節(jié)桿菌酶，開始消化細(xì)胞(這—步可確定酶消化的最佳時(shí)間);

最佳時(shí)間的確定

準(zhǔn)備20ml 5%SDS溶液分光光度計(jì)調(diào)至800nm，空白對(duì)照為800ul5%SDS及200ul SCE;②準(zhǔn)備10個(gè)離心管，編號(hào)為0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50(根據(jù)時(shí)間編號(hào));取上述8步中的另—管細(xì)胞，取出200ul加入至0號(hào)管中，放置冰上，此為0點(diǎn);

加入7.5ul藤黃節(jié)桿菌酶在剩余的細(xì)胞中，輕混，30C孵育（不要晃動(dòng))用來(lái)建立最佳時(shí)間所用2min時(shí)取200ul懸浮液至2號(hào)管中，同理4,5,6,7,8min時(shí)重復(fù)操作，讀樣品OD800值;

用公式計(jì)算細(xì)胞去壁的效率:%去壁率=100-{ (T時(shí)間OD800-0時(shí)間OD800值)x100}

10）計(jì)算出去壁率為70%左右時(shí)，得出最佳消化時(shí)間，同樣操作加入7.5ul消化酶于另一管中消化細(xì)胞11)室溫離心去除懸浮液，1M山梨醇洗滌一次，0.6mlCaS懸浮細(xì)胞，立即轉(zhuǎn)化，去壁的細(xì)胞應(yīng)立即轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化畢赤酵母

1）取100ul將去壁細(xì)胞，放入1.5ml離心管中(滅菌);

2)準(zhǔn)備10ug線性化質(zhì)粒（預(yù)冷）與去壁細(xì)胞混合，加入1ml新鮮PEG/Cat溶液，輕混，室溫孵育10min;3）室溫750rpm離心10min，去除PEG/Cat溶液;并用150ulISOS培養(yǎng)基懸浮轉(zhuǎn)化細(xì)胞，室溫孵育20min;4)加入800ul 1M山梨醇，涂平板;

5）取200ul轉(zhuǎn)化細(xì)胞和RD(液體）混勻倒于RDB平板上，凝固后導(dǎo)致平板，30℃培養(yǎng)4-6天，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子;6）取100ul稀釋細(xì)胞，與RDH（(液體)混勻，涂在RDHB上，凝固后倒置生長(zhǎng)，30℃培養(yǎng)4-6天，出現(xiàn)克隆，表明去壁細(xì)胞可再次生長(zhǎng)為分裂細(xì)胞。

陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選與蛋白表達(dá)- Mut+和Mut表型的判斷

待轉(zhuǎn)化子在平板上生長(zhǎng)一段時(shí)間后，進(jìn)行Mut*和Mut的篩選。挑取單克隆，在MM及MD培養(yǎng)基上劃線或點(diǎn)(先在MM平板上點(diǎn)，再在MD平板上點(diǎn)，一個(gè)克隆換一次牙簽)，30C培養(yǎng)2天。觀察，在MD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而在MM培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或長(zhǎng)的很小即為Mut5表型，其余為Mut+表型。

Mut+的誘導(dǎo)表達(dá)

1）挑取單菌落，搖菌，在25mlIMGY或BMG或BMGY培養(yǎng)基中，30°℃C，30Orpm培養(yǎng)至OD600為2-6(培養(yǎng)15-18h左右觀察);

2）室溫2000rpm離心5min，收集菌體，用上述培養(yǎng)基重懸，使OD600為1.0左右;將菌液至于1L搖瓶中，30°C300rpm培養(yǎng)，每24小時(shí)加入100%甲醇，至終濃度為0.5-1.0%;

3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣（1ml）至于1.5ml離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間;

4)可以用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況。

Mut5的誘導(dǎo)表達(dá)

1）挑取單菌落，搖菌，在25mlMGY或BMG或BMGY培養(yǎng)基中，30°C，300rpm培養(yǎng)至OD600為2-6(培養(yǎng)15-18h左右觀察);

2）室溫2000rpm離心5min，收集菌體，用上述培養(yǎng)基重曇，使OD600為1.0左右;將菌液至于1L搖瓶中，30°℃300rpm培養(yǎng)，每24小時(shí)加入100%甲醇，至終濃度為0.5-1.0%;

3）根據(jù)時(shí)間點(diǎn)取樣(1ml)至于1.5ml離心管中，離心收集上清和菌體，分析蛋白表達(dá)量和最佳收獲時(shí)間;4）可以用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行分析鑒定表達(dá)情況。