說(shuō)明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。
主要知識(shí)點(diǎn)：
針對(duì)不同的樣品類型提取蛋白質(zhì)的步驟和方法：
- 動(dòng)物組織樣品
- 動(dòng)物細(xì)胞樣品
- 石蠟包埋樣品
- 植物組織樣品
- 細(xì)菌樣品
- 體液樣品
- 從亞細(xì)胞器中提取蛋白
動(dòng)物組織樣品
第一步：剪碎去血
將樣品放入PBS緩沖溶液中剪碎，倒掉變色的溶液，換入新的PBS，繼續(xù)剪，一遍一遍地重復(fù)，直到PBS溶液不變色為止。比如肝臟組織，洗完后整個(gè)是一個(gè)偏黃色的組織。在這個(gè)過(guò)程中，我們需要用剪刀和鑷子剝離血管組織和脂肪組織等，這些組織的存在會(huì)對(duì)我們對(duì)樣品，比如肝臟組織的蛋白質(zhì)類型產(chǎn)生干擾。去血的過(guò)程中同時(shí)需要加入蛋白酶抑制劑。
第二步：稱重
為了稱量更精確，洗滌之后可以用濾紙將樣品吸干，然后再稱重，能比較準(zhǔn)確地知道我們大約使用了多少組織樣品。
第三步：碎裂
碎裂樣品的方法在上一篇推文里有詳細(xì)的介紹，包括液氮研磨、勻漿等機(jī)械破碎，溫差法、壓力法等物理破碎，以及加入變性劑等化學(xué)處理法。通常情況下呢，用液氮研磨就夠了，研磨到完全變成粉狀。但如果用單一的方法破碎效果不好，或者操作起來(lái)工作量太大，也可以進(jìn)行多方法的組合。比如十幾個(gè)或幾十個(gè)樣品，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的運(yùn)動(dòng)量估計(jì)也差不多了，累成狗！這時(shí)候可以考慮使用組織破碎儀，一次可以做八個(gè)十個(gè)的，一起震碎，那就輕松多了。
第四步：裂解
破碎以后，加入裂解液，反復(fù)震蕩，讓樣品充分溶解，裂解液的用量通常是
組織重量：裂解液的體積=1：5
也就是說(shuō)，1克組織，通常加入5ml的裂解液。
在裂解時(shí)，眼睛不要只顧著看手機(jī)或者盯著天花板發(fā)呆，要好好觀察樣品的情況，如果發(fā)現(xiàn)仍然有大塊的組織，或者很多絮狀的組織，則說(shuō)明上一步碎裂的工作做得還不夠。這時(shí)可以加入超聲的方法，或者用組織勻漿器進(jìn)一步碎裂，從而保證蛋白提取比較成功。
有哪些裂解液可選呢？
4%SDS，溶解性特別強(qiáng)，很適合對(duì)膜蛋白或疏水性蛋白的提?。?/p>
常規(guī)的8M尿素，也不弱。
Tips
如果用的是4%SDS，千萬(wàn)不要用超聲進(jìn)一步碎裂！因?yàn)镾DS是一種強(qiáng)去污劑（十二烷基磺酸鈉，我們平常用的洗衣粉里就有），如果進(jìn)行超聲，會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫，既達(dá)不到很好地溶解樣品的目的，又引來(lái)干擾，搞得我們很難控制提取蛋白的過(guò)程。
第五步：離心
裂解并震蕩以后，4℃ 12000rpm離心半小時(shí)，然后吸取上清液。
特別注意：
有些樣品脂肪比較多，比如小鼠肝臟樣品，可以看到提取時(shí)上面有很大一層浮油，下面還有一堆沉淀，如果是新手，又自我要求很高，通常會(huì)想要把所有清液都吸取出來(lái)，不浪費(fèi)一點(diǎn)樣品。這其實(shí)很難做到！弄得不好，就會(huì)帶入脂肪組織和沉淀組織，給后續(xù)的實(shí)驗(yàn)引入污染，造成更多的損失，得不償失?。⊥扑]的做法是：吸取離上層浮油及下層沉淀都有一定距離的中間部分，這樣取出來(lái)的蛋白就純凈多了。
說(shuō)到這里，插一句，以往的經(jīng)驗(yàn)，常規(guī)小鼠和人的組織樣品，提取效率大約為0.7%，也就是說(shuō)，如果有100mg的組織，能提到的蛋白大概是700 μg 。做常規(guī)的質(zhì)譜分析，有100-200mg的蛋白就夠了。如果樣品充足，我們可以分成幾份，先提取一部分做實(shí)驗(yàn)試試，整個(gè)流程走下來(lái)沒(méi)問(wèn)題的話，再提一部分，這樣也比較保險(xiǎn)，不會(huì)出現(xiàn)全軍覆沒(méi)的慘劇。余下的樣本，還可以做做Western驗(yàn)證或者酶活啥的。
如果樣品量特別少，例如小鼠卵巢，一共也就黃豆那么大，這種情況下可不能用液氮研磨，因?yàn)榇蟛糠謽悠范紩?huì)被刮到研缽的壁上，損失很大！可選的方案是：將小鼠卵巢放進(jìn)試管里，直接在管子里剪碎去血，加入裂解液，用組織破碎儀或者超聲破碎，也可以用4%SDS提?。?95℃，5分鐘）。這種情況就不要弄太多的碎裂步驟了，步驟越少，樣品的損失就越少。
動(dòng)物細(xì)胞樣品
針對(duì)動(dòng)物細(xì)胞樣品的處理方法有很多，我們來(lái)看看幾種常見的套路：
A． 最簡(jiǎn)單的方法：
把細(xì)胞從培養(yǎng)皿里取出來(lái)，先加入PBS把培養(yǎng)基洗掉，再加入裂解液，通常25mm的培養(yǎng)皿加入400-700μL裂解液。然后用細(xì)胞刮直接刮取培養(yǎng)皿表面，不停地刮，相當(dāng)于是一個(gè)機(jī)械力的破裂，而細(xì)胞表面是最容易進(jìn)行破裂的。刮完后收集裂解液和細(xì)胞樣品到EP管里，然后進(jìn)行冰上裂解。這是最快最直接有效的方法。
Tips:
通過(guò)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的保存比組織樣品或細(xì)胞樣品的保存來(lái)得更加穩(wěn)定，所以拿到細(xì)胞后直接提取出來(lái)蛋白進(jìn)行保存更好。
B．多組細(xì)胞平行實(shí)驗(yàn)處理方法：
當(dāng)需要處理多組細(xì)胞，而每組細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間有間隔時(shí)，如果希望后續(xù)的分析是平行的，那么可以先分別胰酶消化以后，收集每組細(xì)胞，液氮或者-80℃保存。等各組細(xì)胞都收集好后，加入裂解液，不超過(guò)200W超聲，放在冰上操作。由于不能用SDS（超聲時(shí)會(huì)引起大量的泡泡），這種情況下，常用的是8M尿素或2M硫脲。超聲一定要在冰上進(jìn)行，因?yàn)闇囟忍貏e高，很容易超過(guò)37℃，循環(huán)周期的時(shí)間通常會(huì)設(shè)定為：5秒超聲，停4-5秒，再5秒超聲，反復(fù)，整個(gè)過(guò)程持續(xù)5分鐘左右。
C．反復(fù)凍融法：
這種方法用得比較少，因?yàn)闅埩舻募?xì)胞殘片還是比較多，我們認(rèn)為提取是不充分的。
D．化學(xué)處理法：
也是非常簡(jiǎn)單粗暴的方法，直接加入4%SDS，95℃水浴，1-5分鐘即可。
通常情況下，我們要求細(xì)胞量需要達(dá)到1E6的數(shù)量級(jí)。當(dāng)然，有一些新發(fā)展出來(lái)的方法，需要的細(xì)胞量會(huì)非常少，比較南方醫(yī)科大學(xué)田瑞軍老師課題組做過(guò)1000個(gè)細(xì)胞的蛋白提取，但這些新方法對(duì)操作的要求也很高，如果你還是個(gè)新手，沒(méi)有足夠的經(jīng)驗(yàn)，直接拿新方法來(lái)做，風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)比較高了。
石蠟包埋樣品
對(duì)于這類樣品的處理，去石蠟是比較麻煩的事情。在石蠟包埋過(guò)程中，樣品中的蛋白質(zhì)或脂肪會(huì)用福爾馬林或甲醇固定，形成交聯(lián)狀的結(jié)構(gòu)，從中提取蛋白是非常困難的。難歸難，遇到了還是要迎難而上，咱們得想一些合適的辦法把蛋白有效地提取出來(lái)。通過(guò)很多次的摸索和實(shí)踐，以下是比較可行的處理步驟：
第一步：去石蠟，先用二甲苯室溫浸泡5分鐘，兩次，再換甲醇室溫浸泡5分鐘，兩次?？雌饋?lái)很簡(jiǎn)單，但整個(gè)過(guò)程中會(huì)經(jīng)過(guò)混旋。
第二步：蛋白裂解，因?yàn)榈鞍妆桓栺R林或甲醇固定得非常緊了，有的人會(huì)選擇加入水，讓樣品泡漲，我們更推薦加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT），充分水化被固定的蛋白樣品，然后勻漿和超聲。
第三步：水化之后，加入4%SDS。對(duì)于4%SDS，通常的處理?xiàng)l件是95℃，5分鐘，但對(duì)于石蠟樣品，交聯(lián)特別厲害，所以推薦95℃下處理60分鐘，再冷卻到室溫。
Tips：
SDS并沒(méi)有在第二步裂解的時(shí)候就加入，是因?yàn)檫@一步需要使用超聲，如果加入了會(huì)產(chǎn)生大量的泡沫。所以我們先讓樣品在一個(gè)緩沖體系里充分水化和擴(kuò)展，在第三步再加入SDS高溫孵育，之后冷卻至室溫進(jìn)行提取。
第四步：離心，參數(shù)為最大相對(duì)離心力16,000 g，離心10分鐘，取上清，就達(dá)到分離的目的了。
石蠟包埋樣品提取的效率通常是，一平方毫米樣品可提取一微克蛋白，大家可以通過(guò)這個(gè)效率值對(duì)樣品中能提取的蛋白進(jìn)行估算。
植物組織樣品
對(duì)于植物組織樣品，難點(diǎn)就在于細(xì)胞壁及葉綠素的去除。
第一步：充分再充分地研磨。由于細(xì)胞壁十分強(qiáng)壯，所以一定要好好地研磨，充分碎裂。一般的勻漿根本搞不定細(xì)胞壁，沒(méi)辦法碎得充分。
第二步：去色素?？梢酝ㄟ^(guò)有機(jī)溶劑多次反復(fù)沉淀樣品來(lái)去除色素，比如丙酮、TCA（三氯乙酸）、甲醇，一次一次地清洗前面研磨成粉的樣品，這樣可以把葉綠素去掉。
第三步，離心取沉淀，然后加入裂解液，讓蛋白充分地溶解。
第四步：進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提。在抽提的過(guò)程中，要看細(xì)胞的破碎程度或者樣品的類型，葉片樣品相對(duì)來(lái)說(shuō)比較簡(jiǎn)單，莖的樣品比較麻煩，它的纖維組織比較大，再加上植物細(xì)胞壁又比較厚，所以我們得用超聲、震蕩，以及各種方法組合，進(jìn)行蛋白質(zhì)的抽提。
第五步：離心取上清，就得到了蛋白溶液。
根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，像葉片這類的樣品，處理起來(lái)比較簡(jiǎn)單，例如水稻的葉片組織提取出來(lái)可以做到8000多個(gè)蛋白；根的樣品稍微麻煩一點(diǎn)，因?yàn)楹刻貏e多，先得烘干，盡量去掉它的水份，干燥后再進(jìn)行研磨提取。否則，我們可能會(huì)加入很多根，但其實(shí)能提取的樣品并沒(méi)有多少?；ǖ慕M織，比如桃花、梨花，也是水分太多的問(wèn)題，需要先干燥。種子組織，例如花生，在破碎成粉后，也需要多次使用有機(jī)溶劑去掉它的脂肪。
總之，根、莖、葉、果實(shí)等，根據(jù)不同的樣品類型，我們需要根據(jù)它的特點(diǎn)設(shè)計(jì)不用的處理步驟，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是通過(guò)有機(jī)試劑去掉它的色素和脂肪組織，水分太多的先烘干再提取，常規(guī)情況就是研磨和去色素。大家清楚了各種處理的用處之后，就可以針對(duì)自己的樣品靈活地處理了。比如棉花樣品，因?yàn)樗w維特別多，你可能就會(huì)想到得通過(guò)研磨和反復(fù)沉淀來(lái)進(jìn)行純化，再進(jìn)行后續(xù)分析。
細(xì)菌樣品
與植物樣品類似，細(xì)菌樣品的細(xì)胞壁也是我們提取蛋白的最大障礙，尤其是像革蘭氏陽(yáng)性菌，以及一些細(xì)菌的亞型，細(xì)胞壁特別厚，破碎的時(shí)候需要更強(qiáng)的參數(shù)，更長(zhǎng)的時(shí)間。
劉曉慧老師分享了兩個(gè)她遇到的例子：有一次做細(xì)菌樣品，不巧它就是一個(gè)細(xì)胞壁特別厚的亞類，最開始采用急熱驟冷，即從-80℃冰箱取出，95℃煮1分鐘，反復(fù)幾次，然后超聲，但是提出來(lái)的蛋白量特別少。最后還是用了液氮研磨的方法，研磨之后再加入裂解液，才提取出大量的蛋白。所以，對(duì)于細(xì)菌的樣品，我們可以嘗試多種方法，測(cè)試一下。
還有一次做酵母樣品，在做超聲的時(shí)候，因?yàn)橛悬c(diǎn)事情離開了，所以超聲的時(shí)間就特別長(zhǎng)，并且?guī)状纬曋g做了急熱驟冷處理。另一位同事使用同樣的方法，只是超聲時(shí)間比較短。最后發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間長(zhǎng)的樣品，破碎地非常好，顯微鏡下看到的都是酵母的碎片，提取到的蛋白也很多，而超聲時(shí)間短的提取到的蛋白就少很多。所以我們?cè)谒榱褬悠窌r(shí)，也可以多嘗試幾種方法，幾種參數(shù)。
體液樣品
體液樣品難點(diǎn)在于高豐度蛋白的去除。以血清為例，前14種高豐度蛋白占血清總蛋白的95%以上。而質(zhì)譜是一種離子飽和性檢測(cè)器，低豐度離子的信號(hào)很容易被高豐度的抑制，從而無(wú)法檢測(cè)到。
我們有很多辦法去掉高豐度蛋白。當(dāng)然，有些情況下，為了保證樣品的完整性，也有人不去除高豐度蛋白，這個(gè)視具體情況而定。另外，高豐度蛋白可能還會(huì)與一些低豐度蛋白相結(jié)合，當(dāng)我們?nèi)サ舾哓S度蛋白時(shí)，往往就會(huì)將這些有意義的低豐度蛋白也去掉，無(wú)法保證分析的完整性。針對(duì)這種情況，用普通的shotgun方法是很難解決的，后面我們會(huì)介紹一種方法，它在高豐度蛋白存在的情況下，仍然可以穩(wěn)定地可重復(fù)地鑒定到很多中低豐度的蛋白。
要去除高豐度蛋白，很多商業(yè)試劑盒都可以幫到我們。它們的原理各有不同，我們來(lái)看幾個(gè)比較常用的。
第一種是Bio-Rad的Proteominer試劑盒。
這類試劑盒的原理是：通過(guò)一個(gè)六肽配基與高豐度蛋白結(jié)合，從而進(jìn)行去除。這種方法是非抗體型的，沒(méi)啥特異性，它不受物種限制和樣品類型限制。當(dāng)樣品進(jìn)來(lái)時(shí)，六肽配基會(huì)優(yōu)先結(jié)合豐度高的蛋白質(zhì)，豐度低的嘛，結(jié)合的機(jī)會(huì)小很多，于是就達(dá)到了分離去除的目的。
通過(guò)這個(gè)辦法處理后，最終能鑒定到的蛋白也是比較多的，從鑒定的數(shù)量上看，與安捷倫的特異性試劑盒差不多。但如果要發(fā)高分的文章，用這種方法容易受到質(zhì)疑，也是因?yàn)樗奶禺愋圆粡?qiáng)，去高豐度有一定的隨機(jī)性，高分雜志不太接受這種隨機(jī)的方法。但如果你的樣品體積特別大，可以先試著用Proteominer做一次，接下來(lái)再使用一些特異性的去高豐度蛋白的方法?；蛘吣愕臉悠窙](méi)有特異性抗體柱可以用的話，也可以考慮這種方法。
第二種是安捷倫的MARS柱。它含有14種蛋白抗體，針對(duì)血清中的高豐度蛋白能很有針對(duì)性地去除，需要的樣品量通常為20μL-40μL，20μL的血清樣品可以得到約100微克的蛋白樣品，40μL的量足夠我們做一次iTRAQ或label free實(shí)驗(yàn)了。
第三種試劑盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的試劑盒，可以去兩個(gè)高豐度蛋白?，F(xiàn)在出了一個(gè)去20個(gè)高豐度蛋白的試劑盒，這是基于抗體方法，針對(duì)性很強(qiáng)，是比較公認(rèn)的方法。
第四種是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns，2015年MCP上發(fā)表了一篇文獻(xiàn)，里面用到這個(gè)試劑盒，先是用特異性柱子去掉14個(gè)高豐度蛋白，然后再特異性去掉50個(gè)中豐度的蛋白，最后可以鑒定到5300多個(gè)血清蛋白質(zhì)。對(duì)比現(xiàn)在常規(guī)的方法，通常只能鑒定到500-600個(gè)血清蛋白，如果高豐度蛋白去除得比較好，用QE的方法做，也只能鑒定到1000個(gè)左右蛋白。這篇文章鑒定出了5300個(gè)蛋白質(zhì)，在血清樣品的蛋白鑒定中確實(shí)是一個(gè)相當(dāng)outstanding的結(jié)果了。
以上是四種比較常用的去高豐度的試用盒?？偟膩?lái)說(shuō)，針對(duì)像尿液這類體積很大的樣品，可以用Proteominer的方法，因?yàn)槠溆嗟幕诳贵w的方法都對(duì)蛋白含量有所要求。去掉高豐度蛋白后，我們可以對(duì)尿液先進(jìn)行濃縮，使它的濃度達(dá)到50μg/μL或更高，再進(jìn)行后續(xù)的蛋白提取，效果會(huì)更好。另外，尿液樣品也可以通過(guò)沉淀的方法對(duì)蛋白進(jìn)行提取。
另外，像腦脊液樣品，也可以通過(guò)Proteominer方法進(jìn)行提取，它的蛋白含量也比較低。劉曉慧老師組嘗試過(guò)用安捷倫的特異性去除14個(gè)高豐度蛋白的試劑盒與Proteominer的隨機(jī)去除6個(gè)高豐度蛋白試劑盒進(jìn)行比較，最后能檢測(cè)到的蛋白結(jié)果都差不多。
亞細(xì)胞器蛋白質(zhì)提取
針對(duì)亞細(xì)胞器的提取，我們分幾步來(lái)完成：
第一步：對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行勻漿，不需要?jiǎng)虻梅浅Ｋ?，通常勻個(gè)10-20下就可以了；
第二步：初步分離，使用差速離心的方法，具體說(shuō)明見上圖。
第三步：用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行再分離。蔗糖密度梯度是連續(xù)的，那么相應(yīng)的亞細(xì)胞器會(huì)在等密度的蔗糖密度區(qū)間內(nèi)沉積。于是，可以將溶酶體、線粒體，以及其它微體分開。然后取出對(duì)應(yīng)的細(xì)胞器，再進(jìn)行裂解和提取。
Tips:
蔗糖密度梯度離心需要使用超速離心機(jī)，平衡及各方面控制都需要比較精準(zhǔn)，所以操作時(shí)特別需要小心。
第四步：對(duì)亞細(xì)胞器進(jìn)行驗(yàn)證。這一步需要引入Western，比如用到一些線粒體特異的抗體，或者細(xì)胞膜、細(xì)胞核特異的抗體，進(jìn)行樣品純度的確證，之后再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。否則，如果樣品中有污染，會(huì)給后續(xù)的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很難解釋的問(wèn)題。
以上是針對(duì)不同樣品的蛋白提取方法，下一篇將繼續(xù)分享樣品前處理的余下幾步，即蛋白提取的質(zhì)量控制、脫鹽、還原烷基化和酶解。
