說(shuō)明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。
主要知識(shí)點(diǎn)：
--蛋白提取的質(zhì)量控制
--脫鹽的處理方法
--還原烷基化及酶解的步驟
--蛋白質(zhì)及肽段的預(yù)分級(jí)
蛋白提取的質(zhì)量控制
我們通過(guò)上一篇筆記里介紹的各種方法把蛋白質(zhì)提取出來(lái)以后，這事兒還沒(méi)完，因?yàn)槲覀冃枰獙?duì)提取出來(lái)的蛋白進(jìn)行一下質(zhì)控，以確認(rèn)是否成功提取出了足夠的蛋白，是否有污染等。
如上圖，質(zhì)量控制分兩個(gè)部分：
含量測(cè)定：檢測(cè)是否有充足的蛋白被提取出。注意上圖里提到的不兼容問(wèn)題，如果你樣品里加過(guò)SDS，就不要用Bradford法來(lái)測(cè)定蛋白濃度，而可以選用BCA方法；反之，如果你樣品里加入了還原劑，就不要用BCA方法來(lái)測(cè)定蛋白，可以選用Bradford法。
SDS-PAGE：檢測(cè)蛋白的提取效率，以及是否有污染。比如我們上了50個(gè)樣，能看到的條帶卻很少，說(shuō)明定量不準(zhǔn)確。如果想從幾組樣品中尋找差異蛋白，特別需要做一次SDS-PAGE檢測(cè)同類(lèi)樣品蛋白的提取效率。
以上圖為例，0號(hào)樣品中間的條帶不見(jiàn)了，可能是提取蛋白不充分引起的差異，也可能是樣品本身的差異。我們可以重新提取一次，先排除是否是提取造成的差異；如果是樣品本身的差異，建議用label free的方法，每個(gè)樣品單獨(dú)做定量，而不要用iTRAQ或TMT標(biāo)記定量，否則會(huì)因?yàn)橹虚g這個(gè)高豐度蛋白的影響，而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。
我們?cè)倏磥?lái)幾種常見(jiàn)的問(wèn)題，以及解決方法，如下圖：
情況1：提取出來(lái)的結(jié)果差異很大。這種情況需要重新提取，以檢測(cè)到底是提取不充分造成的差異，還是樣品本身的差異；
情況2：左邊是分子量marker,右邊是實(shí)際樣品，可以看到實(shí)際樣品的條帶很少，可能是提取不充分，需要重設(shè)提取參數(shù)，使用更劇烈的條件，更長(zhǎng)的時(shí)間，重新提??；
情況3：橫紋、縱紋比較多，很可能是核酸或脂蛋白的影響，這種情況需要進(jìn)行脫鹽處理，也就是利用脫鹽柱與肽段結(jié)合，而與其它物質(zhì)不結(jié)合，從而達(dá)到去除污染的目的。
情況4：兩個(gè)條帶很類(lèi)似，但一條明顯比另一條淡?？赡茉斐蛇@種情況的原因有哪些呢？第一種情況，由于這是同樣類(lèi)型的樣品，比如都是小鼠肌肉組織，一個(gè)樣品的蛋白質(zhì)抽提充分，而另外一個(gè)樣品蛋白抽提不充分，就會(huì)導(dǎo)致兩條帶不一樣，這種情況下需要重新抽提。還有一種可能，考慮到是等量上樣跑的SDS-PAGE，如果兩個(gè)條帶顯示出的蛋白含量差別很大，則可能因?yàn)閰⒖嫉暮繙y(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確引起的，這時(shí)候需要重新定量。
脫鹽
蛋白提取后，還需要做脫鹽處理，我們來(lái)看看可以用哪些方法實(shí)現(xiàn)。
超濾：可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用于體積較小的樣品。操作步驟可以是，從100μL超濾濃縮到40μL，再加緩沖液至100μL，再超濾到40μL，反復(fù)幾次。事實(shí)上，超濾是很難把污染（比如SDS）完全去掉的，最終仍然會(huì)有極少量的污染物存在，但當(dāng)這些污染物的濃度降到一定程度時(shí)，則樣品的純凈度我們認(rèn)為是可以接受的了。
Tips:
樣品中的尿素濃度需要控制在1M以下才能不對(duì)樣品造成影響，我們提取蛋白時(shí)使用的是8M尿素，直接稀釋8倍的話，造成樣品體積太大，下一步加入酶后，則酶和蛋白的濃度會(huì)特別低，酶解效果受到很大影響。另外，體積太大處理起來(lái)也不方便。這時(shí)也可以使用超濾的方法，多步稀釋?zhuān)瑢⒛蛩氐臐舛冉档?M以下。
透析：也是可以截留10kDa及以上的蛋白分子，適用于體積比較大的樣品，比如尿液，可以將鹽透析至外面的透析液里。
丙醇沉淀：-20℃丙酮（V樣品：V冷丙酮=1：3以上）沉淀2個(gè)小時(shí)以上。
C18色譜柱脫鹽法：Waters公司生產(chǎn)的XBridge C18色譜柱，利用柱子上的填料與蛋白結(jié)合，而鹽類(lèi)物質(zhì)則流穿過(guò)去，從而達(dá)到分離的目的。
還原烷基化及酶解
脫鹽完成以后，接下來(lái)我們就要進(jìn)行相當(dāng)重要的一步：還原烷基化及酶解。整個(gè)流程，大伙兒看下面這張圖：
這里面有兩件事要先跟大伙兒聊聊。
首先，我們來(lái)說(shuō)說(shuō)為什么步驟里要把丙酮沉淀放在烷基化以后。通過(guò)之前的學(xué)習(xí)，我們知道丙酮可以溶解樣品的去污劑、還原劑等，而蛋白是不會(huì)在丙酮中溶解的，而是會(huì)沉淀下來(lái)，這樣就達(dá)到了去除雜質(zhì)的目的。
烷基化以后，球狀蛋白變成鏈狀，再通過(guò)丙酮沉淀去掉尿素或SDS等污染物，然后復(fù)溶（即重新溶解，以備下一步酶解操作），那么鏈狀的蛋白比球狀蛋白的復(fù)溶效果會(huì)更好，可以避免因?yàn)閺?fù)溶不充分而造成的損失。因此，丙酮沉淀要放在烷基化之后再做。
另外，關(guān)于酶切這一步，有些抗體如果只用胰酶進(jìn)行酶切，由于酶切位點(diǎn)太少，導(dǎo)致切出來(lái)的肽段太長(zhǎng)，不便于質(zhì)譜檢測(cè)。這種情況下可以結(jié)合其它酶，比如Lys-C，進(jìn)行多酶酶切，使肽段變得短一些。經(jīng)過(guò)測(cè)試我們發(fā)現(xiàn)，用Lys-C+胰酶酶切，比只用胰酶酶切，可以提高10%-20%的鑒定率。
酶解需要在buffer體系下完成，比如25mM碳酸氫銨體系（易揮發(fā)，pH 7-8）最為常用，或者也可以使用TEAB（ triethyl ammonium bicarbonate，三乙基二乙胺鹽，10-100mM）。
Tips:
如果做iTRAQ（或TMT）標(biāo)記，最好用TEAB，而不是碳酸氫銨體系。因?yàn)閕TRAQ（或TMT）試劑是標(biāo)記末端氨基，碳酸氫銨上的氨基也會(huì)被標(biāo)記上，影響蛋白的標(biāo)記效率。
酶的用量可以參考以下的公式：
W（酶）：W（底物）=1:20 – 1:50
此外，需要注意的是胰酶酶解的兼容性問(wèn)題。胰酶只能耐受最多1M的尿素，且不能與SDS同時(shí)使用。
蛋白質(zhì)及肽段的預(yù)分級(jí)
前面提過(guò)，質(zhì)譜儀是一種離子飽和性?xún)x器，高豐度蛋白的存在會(huì)對(duì)低豐度蛋白的信號(hào)產(chǎn)生抑制，并且質(zhì)譜儀反應(yīng)也需要一定的時(shí)間。例如，人的細(xì)胞內(nèi)通常會(huì)表達(dá)20300種蛋白，它們酶解后，每種蛋白會(huì)產(chǎn)生10-20種肽段，那么就有幾十萬(wàn)種肽段，質(zhì)譜很難同時(shí)檢測(cè)到這么多種肽段。所以對(duì)肽段混合物進(jìn)行分級(jí)，可以降低檢測(cè)的難度，得到更多的肽段/蛋白鑒定結(jié)果。
我們既可以從蛋白水平進(jìn)行分離，也可以從肽段水平進(jìn)行分離，還可以將多種分離手段結(jié)合起來(lái)。從蛋白水平的分離，大家都比較熟悉吧？通常我們用SDS-PAGE或IEF等技術(shù)，利用蛋白質(zhì)的分子量、形狀、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)的不同，將混合在一起的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
第二種分離方案是在肽段水平上進(jìn)行，根據(jù)肽段的不同性質(zhì)，使用不同填料進(jìn)行分離。
SCX（Strong Cation Exchange）：是以硅膠為基質(zhì)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，可以與陽(yáng)離子結(jié)合，并通過(guò)buffer進(jìn)行離子交換，將陽(yáng)離子分離和洗脫出來(lái)，達(dá)到與其它不帶陽(yáng)離子的肽段分離的目的。
SAX（Strong Anion Exchange）：硅膠鍵合季銨基團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換柱，可以與陰離子結(jié)合，并通過(guò)buffer進(jìn)行離子交換，將陰離子分離和洗脫出來(lái)，達(dá)到與其它不帶陰離子的肽段分離的目的。
RPLC（Reverse Phase Liquid Chromatography）：反相液相色譜柱，與正相柱在表面鍵合極性官能團(tuán)不同，反相柱的表面鍵合的是非極性的官能團(tuán)，例如，鍵合十八烷基官能團(tuán)，稱(chēng)為C18柱，其它常用的還有C8，C4和C2等。這里我們選用C18柱，根據(jù)肽段疏水性的不同，達(dá)到分離的目的。
HILIC（Hydrophilic interaction liquid chromatography ）：親水色譜柱可以用來(lái)分離極性化合物。由于強(qiáng)極性肽段在反相色譜柱中保留情況都比較差，很難將它們分開(kāi)，而親水色譜柱卻可以用來(lái)固定強(qiáng)極性的肽段，并結(jié)合高比例有機(jī)相與低比例水相組成的流動(dòng)相，來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的目的，且這樣的流動(dòng)相組成尤其有利于提高電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）的靈敏度。
High pH - Low pH RPLC：用pH10的液相條件，結(jié)合pH2的RPLC酸性條件，進(jìn)行分離。
Tips:
通常，我們通過(guò)RPLC與質(zhì)譜聯(lián)用。因?yàn)镽PLC體系是用水和乙腈，易揮發(fā)，不含鹽，可以直接送入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。而像SCX/SAX這類(lèi)正相柱，需要通過(guò)高鹽的體系將樣品洗脫下來(lái)，所以它與質(zhì)譜不兼容。我們?cè)谧龆嗉?jí)分離時(shí)，前面都會(huì)有各種鹽的洗脫，最后才是RPLC，然后就可以直接連質(zhì)譜了。
多維分離：例如，先從蛋白水平進(jìn)行分離，再?gòu)碾亩嗡竭M(jìn)行分離，或者多種肽段水平的分級(jí)分離結(jié)合起來(lái)使用。接下來(lái)我們重點(diǎn)聊一下各種多維分離的策略和效果。
我們先來(lái)看看上面這張圖。左上角的“A圖“展示的是通過(guò)High pH - Low pH RPLC將樣品分成了40個(gè)餾分，然后進(jìn)行叉開(kāi)的合并，合并為20個(gè)餾分，這樣的合并可以讓樣品中的肽段分布更加均勻。
右上角的”B圖”展示的是通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分離，也分成20個(gè)餾分，然后用兩種合并方案，分別合并為5個(gè)餾分和6個(gè)餾分，這樣做的目的也是為了讓樣品的肽段分布更加均勻。
左下角的“C圖”針對(duì)同一種樣品，對(duì)High/Low pH RPLC和SDS-PAGE兩種分離策略進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)兩種分離方法后，有5408個(gè)蛋白是都可以鑒定到的，另外有1951種蛋白是只在High/Low pH RPLC分離策略中鑒定到的，而用SDS-PAGE分離，則可以鑒定到其它389種蛋白。從這個(gè)圖上看，兩種方法有互補(bǔ)性。
右下角的四幅小圖說(shuō)明，當(dāng)我們?cè)谧龇旨?jí)分離時(shí)，分的級(jí)別越多，能鑒定到的蛋白也就越多。不過(guò)這種增長(zhǎng)并不是呈線性關(guān)系的，分級(jí)的級(jí)數(shù)達(dá)到一定程度時(shí)，能鑒定到的蛋白數(shù)量的增長(zhǎng)就會(huì)飽和。所以比較省時(shí)省力又能保證效果的做法時(shí)，選擇一個(gè)合適的分級(jí)數(shù)即可。
我們來(lái)看一下目前發(fā)表的文獻(xiàn)里，利用多級(jí)分離所能鑒定到的蛋白數(shù)量。
一篇2013年發(fā)表在MCP上的文獻(xiàn)報(bào)道，采用RP-RPLC兩級(jí)分離，分成常規(guī)的24個(gè)餾分，上樣量為100μg，在一天內(nèi)能檢測(cè)到8000多個(gè)蛋白。
一篇2013年發(fā)表在Nat Comm上的文獻(xiàn)報(bào)道，先采用RP柱分級(jí)，再使用SAX分離，然后通過(guò)1米的長(zhǎng)柱子反相色譜分離。樣品為人的胚胎干細(xì)胞，上樣量仍然為100μg，在線分離8天檢測(cè)了9818個(gè)蛋白，如果分離時(shí)間延長(zhǎng)到24天，則可以檢測(cè)13075個(gè)蛋白。
一篇2014年發(fā)表在Nat Method上的文獻(xiàn)報(bào)道，采用IEF（等電聚焦電泳，isoelectric focusing）與RPLC結(jié)合，樣品是人的上皮癌細(xì)胞，上樣量為800μg，分成了360個(gè)餾分，耗時(shí)超過(guò)15天，一共分析到13078個(gè)蛋白。
就像前面說(shuō)到的，對(duì)蛋白及多肽分離的級(jí)數(shù)越多，能鑒定到的蛋白也就越多，但常常因?yàn)闄C(jī)時(shí)的限制，再加上這種變化趨勢(shì)到一定程度總會(huì)飽和，所以我們通常有個(gè)權(quán)衡。比如常規(guī)的分10個(gè)餾分，基本上可以鑒定到5000-8000個(gè)蛋白。如果是血清樣品，可以餾分更多一些，尤其是RPLC一維，如果分到40或60個(gè)餾分，再合并為10或20個(gè)餾分，比直接分成10個(gè)或20個(gè)餾分能鑒定到的蛋白要多30%左右！
Tips:
對(duì)于分餾分，通常是利用C18的色譜柱來(lái)分級(jí)分餾分，這個(gè)沒(méi)有試劑盒。
樣品前處理的各個(gè)步驟就介紹到這，下篇將繼續(xù)分享樣品前處理的最新方法與進(jìn)展
