說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學(xué)院與康昱盛主辦的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)絡(luò)大課堂整理而成，侵刪。該課程由復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院（IBS）的劉曉慧博士所授。
主要知識點(diǎn)：
樣品前處理需要達(dá)到的目的
不同類型樣品提取方法及進(jìn)展介紹
不同預(yù)分級策略介紹
樣本前處理
上面的圖描述了整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)的分析流程：咱們先從組織、體液或細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)，拿到蛋白混合溶液（根據(jù)你的研究目的，可以對蛋白先做分離，或者不分離），接下來還原烷基化（還原的過程是將蛋白的二硫鍵打開，然后烷基化可以修飾巰基，防止游離的巰基再生成二硫鍵）處理，并酶解成肽段。紅線以上都屬于樣品的制備階段。
既然蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的目的，是為了盡可能準(zhǔn)確地對盡可能多的蛋白進(jìn)行檢測，那么，順理成章的，我們做這些復(fù)雜的前處理的目的，就是要減少在實(shí)驗(yàn)階段對蛋白的人為降解和修飾，釋放盡可能多的肽段，送進(jìn)質(zhì)譜來檢測。
為了更好地聊這個(gè)問題，我們先來復(fù)習(xí)一下如何利用質(zhì)譜檢測蛋白質(zhì)，以此來反推前期樣品處理需要達(dá)到怎樣的目的。
拿到處理好的蛋白樣品以后，我們先將樣品酶解成肽段，得到一級譜圖，再由肽段離子與惰性氣體碰撞生成碎片離子，得到二級譜圖。然后我們用實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖進(jìn)行匹配，從而判斷肽段的氨基酸組成，然后再根據(jù)肽段反推出蛋白質(zhì)。
上圖的最下面是是數(shù)據(jù)庫里搜索的序列，綠色部分是置信度在95%以上的肽段，紅色是置信度在50%以上的肽段?；谶@些置信度比較高的肽段，我們才能推斷出這個(gè)蛋白存在于樣品中。所以，對于每個(gè)蛋白質(zhì)來說，根據(jù)實(shí)驗(yàn)譜圖匹配到的肽段越多，對于這個(gè)蛋白的鑒定結(jié)果就越可信。
那么，樣品預(yù)處理時(shí)，首要目的就是避免隨機(jī)降解，才能得到用特定蛋白酶特異性剪切得到的肽段，拿這些肽段生成的實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖比對，才能得到可靠的比對結(jié)果。否則，蛋白的隨機(jī)斷裂位點(diǎn)與特異性酶切位點(diǎn)根本對不上，那拿到的實(shí)驗(yàn)譜圖與理論譜圖完全就是兩回事，最后的結(jié)果就是，要么檢測不到蛋白，要么檢測到的都是錯(cuò)的。
樣本的收集與保存
樣本預(yù)處理之前，我們需要先收集和保存樣品。這一步可不能馬虎，如果收集的方法或者保存的方式不得當(dāng)，就會嚴(yán)重影響后面的預(yù)處理步驟以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果！以下三類樣品的收集與保存尤其需要留意：
組織樣品
1） 對于人體手術(shù)切除的組織，有條件的話，最好用PBS（磷酸緩沖鹽溶液，作為溶劑，起溶解保護(hù)試劑的作用）取完之后直接去血。如果沒有去血，可以-80℃液氮保存，干冰運(yùn)輸。
2）對于小鼠、大鼠、兔子之類的組織樣品，建議用灌流的方式來去血，尤其是像肝臟、胃、心臟這類大的組織，可以直接用灌流的方式去血，去得最干凈。其次的方案是在后期剪碎的時(shí)候去血。
話說，這里為什么要強(qiáng)調(diào)去血呢？因?yàn)檠褐杏惺畮追N含量特別高的高豐度蛋白質(zhì)，占了血液蛋白總量的95%，如果你的研究目標(biāo)并不包括血液蛋白，而這部分蛋白又存在于樣品中，那就悲劇了。大家回憶一下，我們第一節(jié)課的聽課筆記中專門提到的數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA），當(dāng)樣品中有大量高豐度蛋白的時(shí)候，來自中低豐度蛋白的肽段信號就會被大大抑制，連進(jìn)入二級質(zhì)譜的機(jī)會都會變得很渺茫，還怎么愉快地檢測？
細(xì)胞樣品
常規(guī)實(shí)驗(yàn)，建議收到5*1E6-1E7個(gè)細(xì)胞以上的樣品量（有些實(shí)驗(yàn)需要的樣品量會少一些，后面會詳細(xì)講）。細(xì)胞取好后，首先用PBS清洗一下細(xì)胞表面，因?yàn)榇蟛糠峙囵B(yǎng)基里面都含有血清，這部分血清得洗干凈了先~
如果是做分泌蛋白研究的話，首先用PBS清洗樣品幾次，再用條件培養(yǎng)基（不含有血清的培養(yǎng)基）進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞情況，大概12個(gè)小時(shí)以后，離心，去掉細(xì)胞碎片，取上清，就能提取到分泌蛋白了。
血清樣品
1）血漿樣品：可以通過醫(yī)院常用的EDTA抗凝管進(jìn)行收集，收集到的血漿會呈懸浮狀態(tài)，離心去掉血細(xì)胞。
2）血清樣品：現(xiàn)在大部分研究都直接針對血清樣品，它的成份更簡單，沒有凝集素，沒有大量的血細(xì)胞，針對性會更強(qiáng)。收集血清樣品時(shí)，直接把血清吸到管子里，室溫靜置讓它凝結(jié)，上清黃色部分就是血清樣品啦。
好，我們收集好樣品后，接下來就開始做樣品前處理了。它分幾步走呢？看下圖：
對于以上這些步驟，后面會詳細(xì)聊，這里我們先做點(diǎn)兒背景鋪墊，大伙兒心里先有個(gè)譜：
鋪墊
鋪墊之一：第二步“充分溶解蛋白”尤為重要，如果蛋白沒有充分溶解，能提取到的蛋白就會很少，達(dá)不到研究目的。
鋪墊之二：在第一、二步，即破碎樣品和溶解樣品的過程中，為了減少人為操作引入的修飾，通常會準(zhǔn)備大量的冰，進(jìn)行冰上的操作。同時(shí)還需要加入蛋白酶抑制劑，防止在操作過程中蛋白被樣品中自帶的蛋白酶降解掉。
說到樣品中自帶的蛋白酶，尤其要高度重視的是胰腺樣品，如果你在室溫下解凍，整個(gè)樣品可以直接化成水。胰腺本身含有非常豐富的胰蛋白酶，在體外的室溫環(huán)境下，胰蛋白酶的活性沒有誰來抑制它，于是可以完全釋放天性，把組織樣品里的蛋白都分解掉了！所以針對胰腺樣品，要非常小心，必須在冰上操作，利用低溫環(huán)境控制蛋白酶的活性。
鋪墊之三：關(guān)于第三步“解旋蛋白質(zhì)”。通常，蛋白質(zhì)都是成球狀的穩(wěn)定狀態(tài)，解旋蛋白質(zhì)就是將球狀蛋白中的二硫鍵打開，讓它形成鏈狀結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)行下一步酶切。以下圖胰島素結(jié)構(gòu)圖為例，胰島素分子通過很多二硫鍵形成穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)，親水基團(tuán)主要集中在表面，而疏水基因都包裹在里面，如果用特異性酶直接作用于這些球狀蛋白，包裹在里面的序列就不容易被酶作用到，酶切的效率就會很低~
如果能將這些二硫鍵打開，球狀結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白分子就會變成鏈狀，酶切位點(diǎn)才能盡可能多地暴露在酶環(huán)境里，這時(shí)候我們再加入特異性酶，就能得到更多的酶解肽段。
鋪墊之四：對于第五步去除雜質(zhì)，其實(shí)伴隨著整個(gè)預(yù)處理的過程。雜質(zhì)都是從哪里來的呢？比如，從組織中帶來的雜質(zhì)，提取溶液、酶解樣品中帶來的鹽等。我們要知道，質(zhì)譜是一個(gè)非常靈敏的儀器，它檢測的是多肽的質(zhì)荷比。所有的鹽類，以及所有會進(jìn)行離子化的雜質(zhì)，都會干擾到肽段的檢測。所以我們會要求進(jìn)入質(zhì)譜之前的蛋白樣品非常干凈。在蛋白水平及肽段水平都會進(jìn)行去除雜質(zhì)的步驟。
樣品的破碎
好，接下來我們就從破碎樣本開始，詳細(xì)聊聊每一步具體應(yīng)該怎么做，需要用到哪些方法、工具和試劑，以及操作的技巧和需要注意的那些小細(xì)節(jié)。
第一步 破碎樣品
樣品破碎的方法主要分三類：
機(jī)械破碎
1）液氮研磨：適用于大部分組織樣品，比如常見的胃臟樣品、腸樣品、肝臟樣品等。把所有的器皿、研缽，以及樣品，都放到-80℃環(huán)境下，然后把樣品放到研缽里，倒入液氨，整個(gè)樣品會凍得非常脆，然后就大力研磨，直到磨成粉末。
2）勻漿：適用于亞細(xì)胞器的破碎，使用Dunce勻漿器。注意哈，勻漿沒有液氨研磨那么劇烈，除亞細(xì)胞器以外的蛋白提取，通常還是建議用液氨研磨，破碎得更充分一些。
3）搗碎法：用研磨的方法破碎樣品，如果樣品量又大，那可是件非常辛苦的事情！于是一些公司推出了細(xì)胞破碎儀，利用玻璃珠或者磁珠劇烈地震蕩，或者用刀片高速旋轉(zhuǎn)，總之，用電力代表人力，幫助我們做樣品破碎。
物理破碎
1）溫差法：通常用于含有細(xì)胞壁的樣品，比如一些細(xì)菌樣品，利用高溫和低溫的反復(fù)變化，破壞細(xì)胞壁。
2）壓力差法：適用于組織樣品，通過高壓和低壓的反復(fù)變化，實(shí)現(xiàn)對組織樣品的破碎。
3）超聲破碎法：適用于細(xì)胞層次的樣品。
化學(xué)處理
使用各種水解酶、變性劑或表面活性劑等，破碎細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的破碎。
事實(shí)操作中呢，我們通常會將幾種方法結(jié)合起來使用。比如先液氨研磨，拿去提取蛋白，檢測一下蛋白含量，發(fā)現(xiàn)破碎不夠充分，于是又再用超聲的方法，或者結(jié)合比較強(qiáng)的變性劑的方法等等，增強(qiáng)樣品破碎的程度，釋放更多的蛋白。
說到化學(xué)處理法，我們來看看樣品前處理中會用到哪些抽提試劑吧。
上面列出的一些重要的試劑，我們來詳扒一下：
8M尿素：這是比較強(qiáng)的變性劑，有時(shí)也會用6M尿素。
需要注意的是，在加入8M尿素以后，所有處理過程不能超過37℃，否則會將蛋白質(zhì)的氨基胍基化，影響蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，影響后續(xù)的酶解，以及質(zhì)譜檢測，后果很嚴(yán)重！另外，如果這一步你用了8M尿素，后面又要用胰酶來做酶解，那么加入胰酶之前，一定要先將尿素稀釋到1M，否則高濃度的尿素會讓胰酶也變性，失去活性。
硫脲：能起到助溶的效果，也是一種還原劑，它的還原性與一些試劑盒是不兼容的，比如BCA試劑盒。
Tips: 處理過程中,我們要注意每一步的溶劑是否與下一步的溶劑兼容（兼容的意思就是，能不能一起使用）。根據(jù)它們的兼容性來進(jìn)行選擇。
4%SDS：很強(qiáng)的去污劑，但與胰酶不兼容，并且很難通過超濾的方法脫去的，它在超濾脫鹽的過程中仍保留在蛋白樣品中間。對于這類去污劑，我們通常會利用有機(jī)溶劑來去除它們，比如丙酮沉淀。
Tips: 這些去污劑，在樣品進(jìn)入質(zhì)譜前都要去除干凈，否則它們會在質(zhì)譜的電場下離子化，影響我們的分析。因此呢，去污劑要慎用！
還原劑：功能是打開二硫鍵，使蛋白分子盡量從球狀變成鏈狀，增加蛋白質(zhì)的溶解性，以及暴露出盡可能多的酶切位點(diǎn)。
蛋白酶抑制劑：夏天尤其需要，當(dāng)溫度比較高的時(shí)候，酶的活性也會較高，蛋白樣品很容易發(fā)生自降解。如果做特殊樣品的處理，比如磷酸化樣品或其它翻譯后修飾樣品的富集，要針對性地加入這一類酶的抑制劑。
有機(jī)試劑：用來沉淀蛋白質(zhì)，去除雜質(zhì)。比如前面提到的去污劑，我們就可以利用有機(jī)試劑來去除它們；另外，針對植物樣品或昆蟲樣品，樣品本身含有很多色素，比如葉綠素，昆蟲翅膀上的色素等，也可以用有機(jī)試劑將色素溶解掉，然后進(jìn)行洗滌。
特別注意：整個(gè)處理過程中，所有使用的EP管、槍頭、裝試劑的塑料瓶，都盡量用進(jìn)口的產(chǎn)品，尤其是當(dāng)使用到強(qiáng)溶解性的溶液！國產(chǎn)的EP管上的材料（聚乙二醇）很容易被這些溶液洗脫下來，進(jìn)入樣品中，并且很難洗脫掉。而聚乙二醇非常容易離子化，會在質(zhì)譜里形成很強(qiáng)的塑料峰，甚至?xí)耆谏w目標(biāo)肽段的峰，造成檢測的失?。?/p>
下次繼續(xù)聊針對不同樣品的蛋白提取方法、提取完的質(zhì)量控制等部分內(nèi)容。
