今天學(xué)習(xí)測(cè)序相關(guān)知識(shí)

學(xué)習(xí)內(nèi)容

1. 怎么區(qū)分一二三代測(cè)序

2. 二代測(cè)序大體流程

3. NGS組學(xué)都包括哪些分類（粗略）

測(cè)序原理和過程

原理介紹視頻：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密碼： 密碼：bxsry4
文章《測(cè)序的世界》：http://www.itdecent.cn/p/101c14c3a1d2

• 一代測(cè)序-Sanger法測(cè)序（準(zhǔn)確，慢，成本高,至今仍是測(cè)序行業(yè)的金標(biāo)準(zhǔn)。）

Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羥基，其在DNA的合成過程中不能形成磷酸二酯鍵，因此可以用來中斷DNA合成反應(yīng)，在4個(gè)DNA合成反應(yīng)體系中分別加入一定比例帶有放射性同位素標(biāo)記的ddNTP（分為：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通過凝膠電泳和放射自顯影后可以根據(jù)電泳帶的位置確定待測(cè)分子的DNA序列

• 二代測(cè)序-大規(guī)模平行測(cè)序（不準(zhǔn)確，快，成本降低）

illumina公司最優(yōu)，原理

1. DNA待測(cè)文庫(kù)構(gòu)建
2. 簇的創(chuàng)建
3. 橋式PCR擴(kuò)增及變性
4. 測(cè)序

測(cè)序方法采用邊合成邊測(cè)序的方法。向反應(yīng)體系中同時(shí)添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標(biāo)記的4中dNTP（如同Sanger測(cè)序法）。這些dNTP的3’-OH被化學(xué)方法所保護(hù)，因而每次只能添加一個(gè)dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會(huì)被洗脫掉。接著，再加入激發(fā)熒光所需的緩沖液，用激光激發(fā)熒光信號(hào)，并有光學(xué)設(shè)備完成熒光信號(hào)的記錄，最后利用計(jì)算機(jī)分析將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為測(cè)序堿基。這樣熒光信號(hào)記錄完成后，再加入化學(xué)試劑淬滅熒光信號(hào)并去除dNTP 3’-OH保護(hù)基團(tuán)，以便能進(jìn)行下一輪的測(cè)序反應(yīng)。Illumina的這種測(cè)序技術(shù)每次只添加一個(gè)dNTP的特點(diǎn)能夠很好的地解決同聚物長(zhǎng)度的準(zhǔn)確測(cè)量問題，它的主要測(cè)序錯(cuò)誤來源是堿基的替換，目前它的測(cè)序錯(cuò)誤率在1%-1.5%之間，測(cè)序周期以人類基因組重測(cè)序?yàn)槔?0x測(cè)序深度大約為1周。

• 三代測(cè)序-單分子測(cè)序技術(shù)（SMRT不準(zhǔn)確，納米技術(shù)準(zhǔn)確，成本低，快）

與前兩代相比，他們最大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對(duì)階段,不同堿基的加入,會(huì)發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類型。

一二三代測(cè)序?qū)Ρ?，引用自生信星?/div>

組學(xué)分類

• 基因組學(xué)（核酸序列分析）

（1）全基因組測(cè)序（WGS）
（2）全外顯子組測(cè)序（WES）
（3）簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（RRGS）
①RAD-Seq基因組作圖（遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜）
②GBS核苷酸序列分析
③2bRAD基因定位
④ddGBS（也就是ddRAD）基因功能分析
（4）以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)
（5）以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)

• 轉(zhuǎn)錄組學(xué)（基因表達(dá)分析）

（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（長(zhǎng)鏈非編碼RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

作用：
（1）獲得物種或者組織的轉(zhuǎn)錄本信息
（2）得到轉(zhuǎn)錄本上基因的相關(guān)信息，如基因結(jié)構(gòu)功能等
（3）發(fā)現(xiàn)新的基因
（4）基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化
（5）發(fā)現(xiàn)可變剪切
（6）發(fā)現(xiàn)基因融合
（7）基因表達(dá)差異分析

• 蛋白組學(xué)

作用：
（1）蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)處理、蛋白及其修飾鑒定
（2）構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)、相關(guān)軟件的開發(fā)和應(yīng)用
（3）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)
（4）蛋白質(zhì)連鎖圖

• 代謝組學(xué)

（1）代謝物指紋分析
（2）代謝輪廓分析

測(cè)序發(fā)展史：150年的風(fēng)雨歷程

【陳巍學(xué)基因】Illumina測(cè)序化學(xué)原理（講的很好，小白能聽懂）

視頻概要：
芯片表面有8個(gè)通道，上面都做了化學(xué)修飾，兩種DNA引物通過共價(jià)鍵種在玻璃表面（不會(huì)被沖掉flowcel）。
DNA文庫(kù)：加了接頭的DNA（打斷，加A，加接頭）。
橋式PCR：將加了DNA文庫(kù)結(jié)合在芯片上擴(kuò)增（接頭盒玻璃表面引物互補(bǔ)），然后NaOH解鏈，然后再結(jié)合接頭擴(kuò)增，解鏈，擴(kuò)增。。。
測(cè)序：帶熒光的dNTP確定堿基
Index：文庫(kù)中加了特定的序列，每個(gè)樣本加一個(gè)。標(biāo)記樣本來源。
雙端測(cè)序：正負(fù)向各測(cè)一遍

思維導(dǎo)圖

測(cè)序入門知識(shí).png