家好，從今天起密碼子將開設(shè)一個(gè)新的連載模塊--微生物多樣性研究10步走，內(nèi)容包括在進(jìn)行微生物多樣性研究的過程中涉及到的知識(shí)點(diǎn)和常見的分析方法辨析。希望本連載能給初入研究的小白濾清思路、獲得啟發(fā)。
通常微生物多樣性分析都是基于二代測序技術(shù)來實(shí)現(xiàn)的。二代測序的上機(jī)、建庫等實(shí)驗(yàn)流程我們暫且不聊，我們從拿到下機(jī)數(shù)據(jù)來講起。
本期先為大家分享一個(gè)基礎(chǔ)概念--OTU。
OTU是大家進(jìn)行菌群多樣性測序分析的時(shí)候，不可避免需要了解的一個(gè)概念。
OTU聚類與注釋
什么是OTU？為什么會(huì)出現(xiàn)這個(gè)概念呢？
菌群多樣性分析是通過二代測序技術(shù)對微生物基因組中的marker基因（細(xì)菌為16S序列，真菌為18S或ITS序列）全長區(qū)段或部分區(qū)段進(jìn)行測序從而得到環(huán)境樣本中微生物種類和豐度信息的，原則上我們把測序得到的序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，就可以獲得該序列對應(yīng)的物種信息了。但是通過測序得到的序列每個(gè)樣本有幾萬條，對每條序列都進(jìn)行注釋的話，工作量十分巨大，并且marker基因在擴(kuò)增、測序過程中存在小部分概率測序錯(cuò)誤，會(huì)降低后續(xù)分析準(zhǔn)確率。所以在生信研究者們在進(jìn)行多樣性研究時(shí)引入了OTU的概念，來有效規(guī)避上述問題。
在數(shù)據(jù)下機(jī)之后，分析之前，根據(jù)序列間的相似性（通常為97%）將序列進(jìn)行聚類，分成多個(gè)的分類單元，一個(gè)分類單元稱為一個(gè)OTU。然后再基于OTU分類單元進(jìn)行物種注釋，常規(guī)方法為在OTU分類單元中選出一條代表序列，用此序列進(jìn)行物種注釋，得到的注釋結(jié)果既為整個(gè)OTU單元的注釋結(jié)果。這樣不僅簡化了工作量，而且OTU在聚類過程中會(huì)去除一些錯(cuò)誤序列，提高分析的準(zhǔn)確性與效率。
OTU聚類與注釋的流程一般為：
1）提取非重復(fù)序列，降低分析中間過程冗余計(jì)算量；
2）去除單序列；
3）按照相似性進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體序列，獲得OTU代表序列；
4）將OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫比對，獲得OTU物種注釋信息。
說到這里大家能對OTU有一個(gè)簡單的認(rèn)識(shí)了吧？你可以把它簡單的理解為我們?nèi)藶樵O(shè)立的一個(gè)低于種的分類學(xué)水平。（OTU的劃分通常比種水平更精細(xì)）
相似性閾值如何確定？
對于OTU聚類相似度閾值很多同學(xué)也存在疑問：為什么要以97%進(jìn)行相似性聚類？96%不行嗎？99%不行嗎？
其實(shí)在生物信息分析中我們所有涉及到的分析參數(shù)：比如聚類的相似性閾值、比對數(shù)據(jù)庫的70%置信閾值等等，都是基于前期生信分析者們的開發(fā)、測試、總結(jié)得到的有較高準(zhǔn)確性的數(shù)值。
對于相似性閾值的研究可以追溯到1973年。唐·J·布倫納認(rèn)為DNA-DNA雜交同源性大于60%的物種屬于同一物種。
1994年，E. STACKEBRANDT and B. M. GOEBEL將16S rRNA相似度和DNA雜交相似度進(jìn)行比較，得出16S rRNA相似度低于97%的，DNA雜交相似度都不高，所以后來科研人員們就將97%作為了默認(rèn)的聚類閾值。
好的，本期分享到此結(jié)束，下期我們來聊一聊OTU抽平（同樣是一個(gè)令人頭禿的問題）
更多微生態(tài)相關(guān)文章：
