這篇文章簡(jiǎn)單來(lái)講講的是：駐留在脂肪組織中的巨噬細(xì)胞利用外泌體調(diào)節(jié)全身胰島素反應(yīng)。
文章亮點(diǎn)：
- 脂肪組織巨噬細(xì)胞(Adipose Tissue Macrophages, ATM)分泌的外泌體將miRNA轉(zhuǎn)移到胰島素靶細(xì)胞
- 用肥胖小鼠的ATM外泌體治療瘦老鼠可引起胰島素抵抗
- 用瘦小鼠ATM外泌體治療肥胖小鼠可改善胰島素抵抗
- 肥胖小鼠的ATM外泌體含有miR-155，可能是導(dǎo)致胰島素抵抗的原因
【摘要】
miRNA是一種調(diào)節(jié)分子，可以被包裝在外泌體中從細(xì)胞中分泌出去。這里，我們展示了肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞分泌的含有miRNA的外泌體(Exos)給瘦小鼠使用時(shí)，可導(dǎo)致瘦小鼠發(fā)生葡萄糖耐受不良和胰島素抵抗。相反，從瘦老鼠身上獲得的ATM Exos，注射給肥胖小鼠，可改善肥胖小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性。miR-155是肥胖小鼠ATM Exos中高表達(dá)的miRNA之一，更早的研究表明PPAR是miR-155的靶基因。我們的結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，敲除miR-155的小鼠具有胰島素敏感性和葡萄糖耐受性。此外，將野生型小鼠的骨髓移植到miR-155敲除小鼠中可以緩和這種表型。綜上所述，我們的研究表明ATM Exos中含有miRNA。這些miRNAs可以通過(guò)旁分泌或內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制被轉(zhuǎn)移到胰島素靶細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞胰島素反應(yīng)、胰島素敏感性和整體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有強(qiáng)大的影響。
引言
胰島素抵抗是2型糖尿病的重要病因，肥胖人類胰島素抵抗最常見(jiàn)的原因。由于全球肥胖率的持續(xù)上升，2型糖尿病的患病率也隨之上升。人類和嚙齒類動(dòng)物肥胖的特征之一是脂肪組織、肝臟、可能還有骨骼肌的慢性未解決的炎癥。這種由肥胖引起的組織炎癥反應(yīng)其中一個(gè)引人注目的組成部分是促炎巨噬細(xì)胞的積聚，尤其是在脂肪組織和肝臟中。許多早期的研究檢測(cè)了這種慢性組織炎癥狀態(tài)，并提出促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子(TNF-a)，是由組織巨噬細(xì)胞分泌的，可直接抑制胰島素敏感性，是肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的一個(gè)潛在病因。然而，抗TNF-a抗體在人類胰島素抵抗和葡萄糖代謝方面的治療療效不顯著，提示有其他巨噬細(xì)胞分泌因子和免疫細(xì)胞因子參與了胰島素抵抗。最近，花生四烯酸衍生的二十碳三烯白三烯B4通過(guò)其特異性受體BLT1發(fā)揮作用，被認(rèn)為是直接降低肝細(xì)胞和肌細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的因素之一。Galectin-3是另一種巨噬細(xì)胞分泌因子，既可促進(jìn)促炎反應(yīng)，又可通過(guò)抑制胰島素受體信號(hào)通路直接阻斷胰島素作用。在這篇文章中，我們報(bào)道了ATMs通過(guò)分泌含有miRNA的Exos進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)胰島素作用的新機(jī)制。
miRNA與mRNA的結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA被募集到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄停滯和mRNA的降解。除了這種本身的細(xì)胞內(nèi)作用，miRNA可以以外泌體內(nèi)含物的形式被細(xì)胞分泌出去，既可以在局部發(fā)揮作用，也可以進(jìn)入血液循環(huán)，在遠(yuǎn)端發(fā)揮作用。也有證據(jù)表明，這些Exos可以被運(yùn)輸?shù)洁徑蜻b遠(yuǎn)的受體細(xì)胞，調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的功能。這些現(xiàn)象導(dǎo)致我們假設(shè)ATMs可分泌外泌體miRNA，作為細(xì)胞外分子調(diào)節(jié)細(xì)胞胰島素作用和系統(tǒng)胰島素敏感性。
結(jié)果
1. ATMs分泌外泌體miRNA
文章第一步先確定ATMs可以分泌包含miRNA的外泌體。
(B)肥胖脂肪組織巨噬細(xì)胞(ATMs)分泌Exos的電鏡分析。標(biāo)尺，200納米。
(C)通過(guò)NanoSight分析測(cè)量肥胖小鼠ATMs分泌的囊泡的顆粒大小。
(D)Western Blot檢測(cè)外泌體(Exo)特異性標(biāo)志物TSG101、syntenin 1及胞外囊泡相關(guān)蛋白標(biāo)志物HSP70、CD63、CD9。這些印跡代表3個(gè)重復(fù)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每個(gè)包含2個(gè)樣本。
(E)肥胖ATMs的Exos用PKH26標(biāo)記，然后加入到3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)中。
(F)EV分泌抑制劑GW4689(10μM)對(duì)3T3-L1受體細(xì)胞表達(dá)ATMs外泌體依賴性miRNA的影響。
數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。n = 4每組(A和E；n = 3 (C)。p < 0.05， *p < 0.01，Student’s t test。
2. 從肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos促進(jìn)胰島素抵抗
從肥胖小鼠中提取的含miRNA的Exos會(huì)損害三種主要胰島素靶組織的胰島素敏感性。
(C - F)葡萄糖輸注率(GIR) (C)、胰島素刺激葡萄糖處理率(IS-GDR)(骨骼肌胰島素敏感性指標(biāo)) (D)、肝臟葡萄糖產(chǎn)生率(HGP) (E)、高胰島素-降血糖鉗位研究中游離脂肪酸水平抑制(FFA抑制)(F)的百分比。
(G - I)通過(guò)Western Blot檢測(cè)胰島素注射后骨骼肌(G)、肝臟(H)和VAT (I)中S473位點(diǎn)的AKT磷酸化水平。這些印跡代表3個(gè)重復(fù)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每個(gè)包含2個(gè)樣本。這個(gè)結(jié)果為了表明胰島素信號(hào)在這些組織中減少。
*Data are presented as mean ± SEM. n = 7 mice for NCD control group (A–F) and n = 8 mice for the other groups. p < 0.05, 1-way ANOVA with Bonferroni’s post-test (A and B) or Student’s t test (C–F).
3. 肥胖小鼠ATM-Exosomal miRNAs損害細(xì)胞的胰島素敏感性
肥胖ATM-Exos在體內(nèi)的作用顯著，我們同時(shí)對(duì)脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和肝細(xì)胞的進(jìn)行了相應(yīng)的體外研究。
(D - F)肥胖ATM-Exos處理后，AKT磷酸化水平在3T3-L1脂肪細(xì)胞、L6肌肉細(xì)胞和原代肝細(xì)胞中的變化。這些印跡代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次包含2個(gè)樣本。
(G)在siRNA誘導(dǎo)的Drosha (M1 ExossiRNA-Drosha)敲除后，從LPS誘導(dǎo)的M1 BMDMs中收集Exos，然后加入3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)。24小時(shí)后測(cè)量脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收。
這些結(jié)果表明，miRNAs與巨噬細(xì)胞來(lái)源Exos可調(diào)節(jié)胰島素敏感性能力有關(guān)。
4. 來(lái)自瘦小鼠的ATM-Exos會(huì)降低肥胖引起的胰島素抵抗
從反面去驗(yàn)證上面實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果。
(C - F)葡萄糖輸注率(GIR) (C)、胰島素刺激葡萄糖處理率(IS-GDR)(骨骼肌胰島素敏感性指標(biāo)) (D)、肝臟葡萄糖產(chǎn)生率(HGP) (E)、高胰島素-降血糖鉗位研究中游離脂肪酸水平抑制(FFA抑制)(F)的百分比。
(G和H)瘦ATM-Exos對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞和L6肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。
這些結(jié)果表明，在瘦ATM-Exos對(duì)肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗具有保護(hù)作用。
5. 肥胖誘導(dǎo)ATM-Exo中miRNA的表達(dá)變化
現(xiàn)在開(kāi)始做機(jī)制。
(B)瘦ATMs和肥胖ATMs中miR-155的表達(dá)水平。
(C)瘦ATMs和胖ATMs分泌的Exos中MiR-155的豐度。
(D - F)經(jīng)過(guò)24小時(shí)的瘦ATM-Exo與胖ATM-Exos處理后，通過(guò)qPCR檢測(cè)脂肪細(xì)胞(D)、L6肌細(xì)胞(E)和原代肝細(xì)胞(F)中miR-155的水平。數(shù)據(jù)歸一化至U6(細(xì)胞)或Exos總蛋白水平。
6. MiR-155損害細(xì)胞胰島素信號(hào)通路
上一個(gè)結(jié)果中列舉了MiR-155表達(dá)的趨勢(shì)，現(xiàn)在開(kāi)始做表達(dá)差異的功能。
(D)過(guò)表達(dá)miR-155后，Western Blot檢測(cè)其靶基因PPAR在3T3-L1脂肪細(xì)胞、L6細(xì)胞和原代肝細(xì)胞中的表達(dá)。同時(shí)也檢測(cè)了PPAR的靶基因GLUT4在3T3-L1脂肪細(xì)胞和L6細(xì)胞中的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)3T3-L1脂肪細(xì)胞、L6肌細(xì)胞和原代肝細(xì)胞中PPAR的暴露時(shí)間分別為100 s、480 s和440 s。在3T3-L1脂肪細(xì)胞和L6肌細(xì)胞中檢測(cè)GLUT4的暴露時(shí)間分別是80秒和60秒。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次包含3個(gè)樣本。
(E)過(guò)表達(dá)miR-155后，受體細(xì)胞中與argonaut蛋白結(jié)合的PPAR mRNA的表達(dá)豐度。
(F)羅格列酮(Rosi)(PPAR激動(dòng)劑)可恢復(fù)過(guò)表達(dá)miR-155對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞和L6肌肉細(xì)胞葡萄糖攝取的影響。
7. ATM-Exo miR-155促進(jìn)肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗
miR-155抑制細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
(C和D)在骨髓移植后HFD喂養(yǎng)20周，對(duì)miR-155KO受體小鼠進(jìn)行GTTs和ITTs。
(E)通過(guò)qPCR分析miR-155KO受體小鼠原代脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中MiR-155的豐度。
(F)在骨髓移植后miR-155KO受體小鼠的原代脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中檢測(cè)miR-155靶基因PPAR豐度。在原代脂肪細(xì)胞中也檢測(cè)到了GLUT4的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)原代脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞中PPAR的檢測(cè)時(shí)間分別為120 s和550 s。檢測(cè)GLUT4蛋白條帶的暴露時(shí)間為150 s。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)包含3個(gè)樣本。
(G和H)測(cè)定骨髓移植后原代脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取和原代肝細(xì)胞的葡萄糖產(chǎn)量。
數(shù)據(jù)以均數(shù)±SEM表示。n = 10只小鼠每組(A-E)和n = 10每組(G-H)。p < 0.05, 的單因素方差分析和Bonferroni’s post-test (A-D) 或Student’s t test(G和H)。*
這篇文章先是確定了表型：ATMs可以分泌外泌體，這些外泌體會(huì)與胰島素抵抗相關(guān)，胖ATM-Exo會(huì)促進(jìn)胰島素抵抗，瘦ATM-Exo可以降低肥胖引起的胰島素抵抗。
然后去探討為何ATM-Exo可以發(fā)揮這樣的作用。發(fā)現(xiàn)ATM-Exo包含miRNA，瘦ATM-Exo與胖ATM-Exo中miRNA的表達(dá)差異顯著，肥ATM-Exos中miR-155的豐度明顯高于瘦ATM-Exos。選擇這個(gè)miRNA主要是根據(jù)研究經(jīng)驗(yàn)（也有可能是課題組剛好有這種轉(zhuǎn)基因小鼠）。然后選了miR-155眾多靶基因中的一個(gè)和胰島素信號(hào)通路相關(guān)的靶基因PPAR，同理選了GLUT4。
最后從正、反、在體、離體等多個(gè)角度去show了一些支持猜想的結(jié)果。
這篇文章思路簡(jiǎn)潔，邏輯連貫，但是在過(guò)渡到選擇靶分子的這一步?jīng)]有必須性。按照這個(gè)差異表達(dá)結(jié)果其實(shí)可以選擇那些差異表達(dá)的另外某個(gè)miRNA去做，說(shuō)不定也可以做出來(lái)相似的結(jié)果。
這篇文章的方法部分可以借鑒一些ATMs分離，外泌體分離提純的方法，還有transwell共培養(yǎng)，骨髓移植等技術(shù)之前沒(méi)接觸過(guò)，需要按需學(xué)習(xí)。
如果你關(guān)注了我，希望你與我一起學(xué)習(xí)，一起成長(zhǎng)！?
