① 特異性：引物應(yīng)在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性，引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補(bǔ)堿基同源。

② 引物長度：一般在15~30堿基之間，引物有效長度Ln=2(G+C)+A+T，Ln值不能大于38。（Ln>38時，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度74℃，不能保證產(chǎn)物的特異性）

③ 目的片段二級結(jié)構(gòu)：要擴(kuò)增的片段單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增片段長度為100~600堿基對。

④ 引物二級結(jié)構(gòu)：引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能多于3bp，一對引物間連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性不能多于4bp。

⑤ 引物的5′端：可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)；插入與缺失突變序列和引入啟動子序列等。

⑥ 引物的3′端：絕對不能進(jìn)行任何修飾，3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能，引物3′端不要終止于密碼子的第3位。

⑦ TM值：按公式Tm=4(G+C)+2(A+T) 估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為50~70℃。盡可能保證上下游引物的Tm值一致，一般不超過 2℃。若引物中的 G+C 含量相對偏低，則可以使引物長度稍長，而保證一定的退火溫度。退火溫度約為TM-4。

⑧ GC含量：G+C含量在40%~60%之間。四種堿基的分布最好隨機(jī)，不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)引發(fā)錯誤。