【進入正題】

前面提到的幾個探究蛋白互作相關(guān)的實驗，其實第一步都需要構(gòu)建合適的質(zhì)粒，那么就少不了設計靠譜的引物了。

通常來說，引物的設計需要遵守一些基本的原則。這些原則很細，很多，也很繁瑣。但實際上對于常規(guī)的引物，并不需要考慮太多，達到實驗目的即可，更多的情況下需要靈活選擇。

一般來說，引物設計需要遵循以下原則：

1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。

2. 引物序列在模板內(nèi)應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。

3. 引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物所對應模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)。

6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應當選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應。

7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應序列而確定。

但是在實際設計過程中，往往很難同時滿足以上條件，因此只需要在設計引物時盡可能滿足即可，沒必要太過糾結(jié)。

同時需要注意，各種模板的引物設計難度不一，具體情況需要具體看待。有的模板本身GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

下面主要介紹以下兩方面的引物設計。

1 點突變引物設計

2 qPCR引物設計

（常規(guī)引物的設計思路在已經(jīng)提到，這里不再重復。）

1 點突變引物設計

在蛋白質(zhì)功能研究過程中常常對其關(guān)鍵的酶活位點、修飾位點進行突變，通過點突變來研究基因中發(fā)揮關(guān)鍵功能的是哪一個結(jié)構(gòu)域，甚至具體到哪一個氨基酸。因此就需要設計點突變引物。

點突變主要的原則就是通過盡量突變較少的堿基數(shù)目而使氨基酸發(fā)生更改。由于氨基酸密碼子第三位具有簡并性，一般不需要進行突變，因此至多突變兩個堿基即可。

1.1單點突變引物設計

比如，將下圖中的Ser突變?yōu)?strong>Ala。

首先，查詢編碼Ala的密碼子：為GCA/GCT/GCG/GCC，根據(jù)改動最小原則，我們選擇將其突變?yōu)?strong>GCC，則只需要改動1個堿基，即TCC→GCC。

設計引物（分兩種情況）：

情況一：構(gòu)建點突變質(zhì)粒

只需下面這一對引物即可。

F-S241A：TGTACACATTGTCACGGACGTACCCGCCGT

R-S241A：ACGGCGGGTACGTCCGTGACAATGTGTACA

可以看到黃色部分為需要突變的氨基酸，紅色的堿基為突變堿基，兩邊各延長一部分完全與模板互補配對的堿基。

但是發(fā)現(xiàn)兩條引物完全互補配對，看似違反了前面所講的原則，但實際上是針對質(zhì)粒點突變精妙的設計。兩條引物有一定幾率與模板匹配，此時便會按5‘-3’方向完整擴增一圈整個環(huán)狀質(zhì)粒，最終形成突變質(zhì)粒的構(gòu)建。

情況二：只對目的基因進行點突變

則除了需要情況一中的兩條引物，還需要在目的基因兩端選取F和R。如下圖：

1.2同時對多個位點進行點突變

針對單點突變，手動選取即可完成，但對于多位點突變就不能蠻干了。這里分享一個在線點突變引物設計的網(wǎng)址：

https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp

該網(wǎng)站可以設計單點和多點突變引物以及刪除或者插入一段DNA序列（?插入時只能插入小的DNA片段）。可以同時設計針對7個氨基酸的突變引物。

進入頁面：

參數(shù)說明：

比如，我們對以下3個位點進行點突變。

從結(jié)果可以看到引物的長度、Tm值及引物與模板相互匹配的序列。

1.3缺失一段序列

比如缺失下圖中67-114之間的序列，（注意：第67位和114位這兩個氨基酸不會被刪除，實際刪除66-113這段氨基酸序列）。

小結(jié)：一般在單點突變和缺失一段序列時，成功率比較高；多點突變時可能就需要多次嘗試并檢測了。

2 qPCR引物設計

Q：qPCR引物設計的問題點：

A：SYBR Green與雙鏈DNA結(jié)合后會產(chǎn)生熒光，如果反應體系中有非特異性擴增或者引物二聚體存在，也將被檢測到，導致實驗結(jié)果的不準確。

因此設計合適的qPCR引物就很關(guān)鍵。

qPCR引物設計的一般原則：

其實這里qPCR引物的設計和常規(guī)PCR的設計也是大同小異。和常規(guī)引物設計一樣，并不能死磕原則，靈活選擇更為重要。

這里可以使用以下軟件和在線網(wǎng)站進行設計：

1.Primer Premier 5.0

設計方法和常規(guī)引物設計一樣，只需根據(jù)實驗需求設置幾個必要參數(shù)即可。這里不進行演示。

2.NCBI Primer blast：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

3.Primer3：

https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/

下面對NCBI Primer?blast和Primer3進行簡單介紹。

NCBI Primer?blast

同樣，我們選擇P53這個基因。點擊Pick Primer進入NCBI Primer?blast界面。

可以看到，上一步選擇的p53序列已經(jīng)加載進來。

接下來看一下界面中幾個重要的參數(shù)設置。

結(jié)果如下：

最后，選擇最優(yōu)引物即可。

Primer3

Primer3屬于傻瓜式操作，各參數(shù)已自動設定，基本無需更改，粘貼序列后直接提交即可。

但這里需要思考一個問題：

是否排名第一的引物對一定最優(yōu)呢？不一定。由于這些引物是未考慮非特異性擴增的。因此在得到候選引物對后，最好還是靈活選擇。以便得出最優(yōu)的引物對，確保實驗的準確性。

除了上述在線網(wǎng)址外，給大家推薦以下軟件和在線網(wǎng)址，助力解決點突變、qPCR等引物設計的各種問題。具體的使用問題各位可以自行摸索，都很簡單，基本上打開就可以使用

1.BioXM

2.http://www.bioinformatics.org/primerx/index.htm

3.https://biodb.swu.edu.cn/qprimerdb/

（qPCR引物數(shù)據(jù)庫qPrimerDB，收錄了包括66種重要植物（擬南芥、水稻、玉米、大豆、馬鈴薯等）等在內(nèi)的147個物種共3331426個基因的51091785對qPCR引物。）