最早接觸PCR是在做科創(chuàng)和本科畢業(yè)論文相關(guān)實驗的時候，通過擴增野生型菌株和突變體菌株的某個基因，然后通過AS-PCR方法，設(shè)置溫度梯度，篩選一對能夠區(qū)別S和M菌株的特異性引物。

那個時候?qū)CR有一個大概的影響，其實在操作方面是沒什么問題的。但是仔細想起來，和其他實驗一樣，都是一知半解，對PCR亦是如此。因此，我覺得有必要重新學習一下PCR相關(guān)的各種技術(shù)和原理。

【進入正題】

PCR (polymerase chain reaction)聚合酶鏈式反應，又稱體外DNA擴增技術(shù)，在1985年由美國Cetus公司的Kary Mullis首創(chuàng)，可以將微量目的DNA片段擴增一百萬倍以上。Kary Mullis本人因此獲1993年諾貝爾化學獎。

前面分享過PCR之歌，這里在系統(tǒng)整理PCR相關(guān)知識之前，重溫一下。

一、PCR的原理

在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。

聚合酶鏈式反應用于擴增一小段已知的DNA片段，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。與活體生物不同的是，PCR只能復制很短的DNA片段，通常不超過10kbp。DNA是雙鏈分子，因此用互補DNA雙鏈的構(gòu)造單位（核苷酸）來度量其大小，單位為堿基對（base pair, bp）。

二、PCR反應成分

template

過多：

非特異性條帶增加。

過少：

PCR產(chǎn)量降低。

primer

預擴增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。

偏高：

非特異產(chǎn)物擴增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。

偏低：

產(chǎn)量降低。

polymerase

耐高熱

偏高：

引物非特異產(chǎn)物的擴增。

偏低：

產(chǎn)物量降低。

dNTP

dATP、dGTP、dCTP、dTTP

過高：

加快反應速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗成本。

過低：

反應速度下降，可提高實驗的精確性。

buffer

Mg2+

Taq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應的特異性和擴增片段的產(chǎn)量。

過量：

能增加非特異擴增并影響產(chǎn)率。

過低：

則酶活性顯著下降。

10~50 mM Tris- Cl (pH8.4)

維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性

25~50 mM KCl

促進引物退火，＞50 mM會抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)

對酶有一定的保護性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙?；腂SA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。

三、PCR反應基本步驟

一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

變性(Denaturation)：

退火或稱接合,復性(Annealling)：

延伸(Extension)：

四、PCR反應條件優(yōu)化

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈完全是保證整個PCR擴增成功的關(guān)鍵。

加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。

溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結(jié)合。

復性溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。復性溫度越低，產(chǎn)物特異性越低。

需根據(jù)引物的Tm值具體設(shè)定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結(jié)合，可以緩慢升溫到70~75°C。

延伸反應時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據(jù)1kb/min增加時間。

這里需要注意，延伸時間過長可能出現(xiàn)非特異擴增。因此需要設(shè)置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數(shù):

其他參數(shù)選定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。

理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產(chǎn)率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)次數(shù)越多，非特異擴增增加。

五、PCR延伸技術(shù)

由PCR延伸而來的技術(shù)很多，這里只介紹日常實驗中常用到的幾種。

1.touchdown PCR

降落PCR，主要用于PCR的條件的優(yōu)化。在許多情況下引物的設(shè)計使得PCR難以進行，例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過高會使PCR效率過低，但退火溫度過低則會使非特異擴增過多。

因此，前面幾個循環(huán)的起始退火溫度設(shè)定為比引物的最高熔解溫度（Tm）再高幾度。前幾循環(huán)溫度逐漸下降至設(shè)定的最終Tm。通過較高溫度獲得特異性匹配較高的模板后，再以較低溫度高效率擴增。

2.RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。

3.real-time PCR/quantitative PCR

實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

4.nested PCR

先用低特異性引物擴增幾個循環(huán)以增加模板數(shù)量，再用高特異性引物擴增。

5.SOE PCR

重疊延伸PCR分為2種：用重疊延伸PCR做定點突變 和 用重疊延伸PCR做序列缺失突變，即重疊延伸PCR技術(shù)(gene splicing by overlap extension PCR,簡稱SOE PCR)

5.1 用重疊延伸PCR做定點突變（由于原理簡單，直接上圖）

該步一定要用pfu酶，不能用Taq酶，因為Taq酶容易在PCR產(chǎn)物末端加A，會造成產(chǎn)物移碼突變。

5.2 用重疊延伸PCR做序列缺失突變

6.高GC含量PCR

具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C堿基間的強氫鍵影響，比較難以擴增。富含GC的序列同時也涉及二級結(jié)構(gòu)。因此，富含GC的序列可導致DNA聚合酶沿模板擴增時“卡頓”并干擾DNA合成。

為了擴增高GC含量的片段，雙鏈模板必須解離，以便引物與模板結(jié)合，并使DNA聚合酶能夠讀取到序列。為了克服強GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加劑或輔助溶劑來幫助DNA變性。然而，這些試劑通常會降低引物的 Tm，所以退火溫度也需進行相應的調(diào)整。

高合成能力的DNA聚合酶由于與模板的結(jié)合能力更強，有利于完成高GC含量PCR。超高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因為較高的變性溫度（如，使用98°C代替95°C）可能會促進雙鏈解離和PCR擴增。

7.AS-PCR

等位基因特異性PCR（ allele specific PCR，AS-PCR ），是指利用引物與模板之間的堿基錯配可以有效地抑制PCR反應，進而達到模板區(qū)分（等位基因區(qū)分）的目的。

由于PCR過程中引物延伸是3'端開始的，所以3'末端的堿基對引物的延伸來說處于至關(guān)重要的位置。如果這個堿基與模板互補，則引物能不間斷延伸，PCR可以正常進行，得到特定長度擴增帶，反之，則不能延伸。所以只要將與正常等位基因所不同的那個突變堿基安排在引物3'最末端，當用某一含突變序列的引物進行PCR時，如果得到特異條帶，表明被測基因含有該種突變。沒有特異擴增帶出現(xiàn)，則表示沒有這種突變。

注意：這里由于僅僅利用了引物3'末尾堿基的錯配，因此需要摸索一個合適的Tm，才能達到檢測目的。

【Reference】

Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" 美國專利第4,683,195號